Kontrolltöö 1. 1. Milline järgnevatest vektorsüsteemidest kasutab peremeesrakku sisestatud DNA konstrukti tsirkulariseerimiseks cre rekombinaasi ? a) Plasmiid b) Mitte ükski c) Kosmiid d) YAC e) P1 2. Üheks väga levinud viisiks reaalaja kvantitatiivse PCR-i (qPCR-i) tegemisel on TaqMan proovide kasutamine. Millisel DNA polümeraasi omadusel, lisaks 5'-3' sünteesi aktiivsusele, põhineb antud tehnoloogia? a) DNA polümeraasi 3'-5' eksonukleaassel aktiivsusel b) DNA polümeraasi 5'-3' eksonukleaassel aktiivsusel c) DNA polümeraasi termostabiilsusel 3. Milliseid mehhanisme kasutatakse rakus geeniekspressiooni inhibeerimisel antisense DNA oligonukleotiididega?
Kasutatakse puhastatud DNA polümeraasi, oligonukleotiidseid parimereid ja dNTP-sid. Põhineb kolmel järjestikulisel reaktsioonil erinevatel temperatuuridel ning tsükleid korratakse umbes 30 korda. Kõigepealt denatureeritakse temperatuuri tõstmisega (tavaliselt 95C kraadi). Mahajahtumisel saavad praimerid seonduda komplementaarselt, see on annealing. Järgneb uue DNA fragmendi süntees DNA polümeraasi ja dNTP-de lisamisega. qPCR – DNA ja RNA paljundamiseks. Hinnatakse automaatselt kohe tekkiva amplifikatsiooni produkti hulka. Kasutatakse fluoressentsi detekteerivat termotsüklerit. Kasutatakse geeni ekspressiooni hindamiseks ning mutatsioonide ning SNPde leidmiseks RT-PCR – reverse transcriptase PCR, RNA kopeeritakse pöördtranskriptaasi kasutades cDNAks, seega vaja mRNAd. cDNA amplifitseeritakse
Võib kasutada ka Trizol vms. reagenti, mille põhimõte on RNA ekstraheerimine guanidiin- isotiotsüanaadi ja fenool-kloroformiga. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti. RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes (qPCR). Valkude eraldamine imetajarakkudest Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti membraanide lahustamiseks (SDS, Triton X-100, NP-40), lisaks veel glütserooli, vajadusel EDTA-d või muid lisandeid. Lüüsipuhvri koostis sõltub sellest, milliseid valke täpselt uurida soovitakse
olekus. Põhimõte seisneb lähedal asuvate lookuste paaride sageduse kindlaksmääramisel nende ristsidumisega. Toimub kolme sammuliselt: 1. Ristsidumine – formaldehüüdi lisamisel üksteisele lähedal asuvad kromatiini segmendid ristseotakse. DNA segmendid ristseotakse valkudega ja valgud ristseotakse üksteisega. 2. Kromatiin fragmenteeritakse ja ligeeritakse 3. DNA puhastatakse ja analüüsitakse (qPCR, sekveneerimine) 3C: one by one analüüs – kasutab 3C lookus-spetsiifilisi praimereid. Tulemus nt interaktsiooniprofiil valitud geenist näitab promootori ja ümbritseva kromatiini interaktsiooni. 4C: tsirkulariseeritud 3C, one by all analüüs – üle genoomne interaktsiooniprofiil üksikule lookusele. 5C: many by many analüüs – analüüsib interaktsioone kahe suurema lookuste kogumi vahel, nt promootorite kogumi ja distaalsete regulatoorsete
annaabi.ee 
