elueerimispuhvri abil. Inkubeerin paar minutit laua peal Tsentrifuugin 1 minuti. Seejärel on tuubi põhjas elueerinud PCRi produkt lahustatune elueerimispuhvris. Kontrollimiseks segan kokku 2 µl eluaati, 6,33 µl MQ ja 1,66 µl 6x värvi. Tsentrifuugin ja kannan geelile. Geeli pilt tulemuste all. Tulemus: Minu rada nr8. Miks on vaja PCR produkti puhastada? Tahame vabaneda kõigest üleliigsest lahuses, nätieks praimeritest, nukleotiididest ja erinevatest sooladest, et need ei mõjutaks meie järgmiseid etappe. Milleks on vaja teha kontrollgeel? 8 Esiteks, et vaadata, kas meie segus on ainult meid huvitav DNA fragment. Teiseks, et kontrollida, kas elueerimisprotsess õnnestus, kas saime ikka kogu DNA ilusti ränist kätte ja tuli meile topsi? Mida tänasest kontrollgeeli pildist järeldad?
Lisaks lisasin juhendist erinevalt ühte auku 20 l, ning pipeteerisin uue puhta broomfenoolsinise kuuendasse auku. Tulemuseks oli küllaltki sujuv värvirida. Blotipaberile oma nime ja mustrit pipeteerides jälgisin, et pipett ei läheks liiga sügavale lahusesse, et pipett oleks otse ning pipeteerimine toimuks sujuvalt, et kogused oleks võimalikult täpsed ning täpid tuleksid ühtlased. 1. Polümeraasi ahelreaktsiooni teostamine a) Paljundamiseks sain plasmiidi pEGFP-FoxO3a-wt, praimeritest kasutasin: · EGFP-3-s-170-F (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3') · SV40p-R (5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3') Praimerid on valitud selliselt, et nad ei moodustaks omavahel dimeere (ehk ei oleks omavahel komplementaarsed) ning oleksid komplementaarsed lõiguga paljundataval DNA-l, millega praimerid seonduvad ning kust algab replikatsioon. b) Kasutatud PCR-i programm: 1. 95 o C 15 minutit ensüümi (polümeraasi) aktiveerimiseks 2
Lühidalt võimaldab PCR ka väga väikest kogust DNA'd paljudnda mitme suurusjärgu võrra. Paljundatakse pikast DNA molekulist korduvalt ainult mingit konkreetset lõiku. Taoline DNA paljundamine tänu erilistele praimeritele → pikemat tüüpi DNA fragmendid. Kasutatakse kokku kahte praimerit (täpsemalt kahte eri järjestusega praimerit, mõlemat lisatakse reaktsioonisegusse väga suurtes kogustes), mille järjestus ja seondumiskohad DNA ahelale on meile teada. Nendest praimeritest üks seondub DNA kaksikheeliksi ühele ahelale ja teine praimer teisele praimerile, nõnda piiritledes ära selle DNA lõigu, mida tahad paljundada. PCR käigus viiakse DNA süntees läbi keskmiselt 20-40 korda järjest. Iga sünteesireaktsioon moodustab ühe “PCR tsükli”. Tsükkel koosneb sisuliselt kindlatest temp-muutustest, mis korduvad ja kus kindla temp. Juures leiab aset kindel osa DNA sünteesi reaktsioonist.
metoodika võimaldab in vitro paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA polümeraasi. Polümeraas ahelreaktsioonil kasutatakse praimeritena tuntud järjestuse alusel sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DNA erinevatele piirkondadele ning milled vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DNA- lõike. Praimerid on alati paarikaupa, st seonduvad erinevate DNA- ahelatega. Esimeses tsüklis sünteesitakse lähtuvalt praimeritest nn pikad DNA- lõigud, mis ületavad teise vastaspraimeri seondumissaite. Teises tsüklis seondub teine vastaspraimer juba sünteesitud DNA-ahelale ning selle ahela teine ots on esimese praimeri seondumissait. Järelikult toimub edasin süntees praimerite seondumissaitide vahel ning selle tulemusel moodustuvadki sama pikkusega DNA- fragmendid. 1. Sekveneeritav DNA denatureeritakse kuumutamisel 92-
annaabi.ee 
