iv. hoolikus supernatandi eemaldamisel (tuleb eemaldada võimalikult suur kogus supernatanti, ilma, et sade kaasa tuleks, vastasel juhul kas kaotatakse osa saagisest, või võetakse kaasa jääke) 6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti, kuhu sisestasime oma inserdi. See võimaldab tükkide pikkuste järgi määrata, kas insert on vektorisse sisenenud või mitte. Protokoll: 1. Pipeteerida: i. 5,9 l vett ii
seejuures võib ühes rakus olla mitu erinevat plasmiidi. Plasmiidi DNA koosneb funktsionaalselt 2-3 piirkonnast; - Plasmiidi replikatsiooni eest vastutavad geenid - Plasmiidi ülekannet teistesse bakteritesse determineerivad geenid (võivad ka puududa) - Struktuurgeenid määravad ära plasmiidi poolt determineeritavad bakteri omadused Determinatsioon – tingimine; põhjustamine 21. Ravimiresistentsuse geenide ülekanne plasmiidilt plasmiidile, plasmiidilt genoomile on võimalik tänu R faktorile, kuna kõik ravimiresistentsust determineerivad geenid asuvad transposoomides ja iga R faktor sisaldab alati IS elemente ja transposoome. 22. Kuidas saab kasutada plasmiidide analüüsi epidemioloogias? Plasmiidse profiili määramine erinevatelt inimestelt isoleeritud bakterites hospitaalinfektsiooni korral on tihti kergem, kiirem ja kindlasti täpsem kui traditsioonilised meetodid mikroobide leviku kindlaks tegemisel haiglas. R
5 vortexi abil. Epsi korgis märgistasin vajalikud asjad markeriga ning jätsin segu üleöö ligeerima +4 C juures. 5. Praktikum – Tranformeerimine Transformeerimise käigus vektor (pSTBlue-1) viiakse bakterirakku sisse läbi membraani. Tava bakteri membraan ei lase sisse DNA molekuli, sellega tuleb neid kompententiseerida, ehk teha rakumembraani läbilaskvaks plasmiidile. Selleks rakud töödeldatakse Ca2+ ja Cl- sisaldava soolalahusega ning jahutatakse 0 ni ja järsku soendatakse 50-ni - Heat shock. Selle protsessi tulemusena on see, et membraanis tekivad augud ning augud kannavad positiivse + laengu. Kuna meie DNA
annaabi.ee 
