13. a. Rakkude fikseerimise ja antikehadega märgistamise protokoll: Vajalike lahuste valmistamine: 1. Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10ml. a. 0,4g PFA puru kaaluda väiksesse keeduklaasi b. lisada 1ml 10x PBSi ja 9ml vett c. soojendada magnetsegajal tõmbe all kuni puru on lahustunud. 2. 1xPBS, 50ml. a. 5ml 10x PBS-i. b. Lisada sellele vett (MQ) 50 ml-ni, segada. 3. PBS-Tween: 1xPBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50ml a. 50ml 1xPBS-ile lisada 50 µl 50% Tween-20 lahust, segada. 4. Permeabiliseerimislahus: 50mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 5ml a. 0,25 ml 1M NH4Cl varulahust b. 0,25 ml 10% Triton X-100 c. 0,5 ml 10x PBS-i d. Lisada vett 5 ml-ni, segada (mitte vahtu ajada). 5. Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2ml a. 0,04 g BSA-d b. 0,02 ml 10% NaN3 c. Lisada 1xPBS-i 2ml-ni. I Fikseerimine 1. Rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde 2. Rakud fikseerida 0,5 ml 4% PFAga PBSis, inkubeerida 15 minutit toatemperatuuril. 3. Pesta rakke 3 korda 5 minutit á 1 ml 1x PBSiga.
See võimaldab signaali amplifitseerimist. 144. 145. Esimene päev – rakkude fikseerimine 1. Valmistada vajalikud lahused: Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10 ml (oli valmis) 146. 0,4 g PFA puru + 1 ml 10x PBSi + 9 ml vett 1x PBS, 50 ml 147. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ, segada PBS-Tween: 1x PBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50 ml 148. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ + 50 μl Tween 20 Permeabiliseerimislahus: 50 mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 1 ml 149. 50 μl 1M NH4Cl + 50 μl 10% Triton X-100 + 100 μl 10x PBSi + 800 μl MQ Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml (oli valmis) 150. 0,04 g BSA-d + 20 μl 10% NaN3 + 1,98 ml MQ 151. 152. 2. Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 3
kuid PFA on üks õrnemastest ja ei muutu valke nii tugevalt nagu näiteks atsetoon. Fikseerimiseks on vaja valmistada lahused: 1) Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10 ml o 0,4 g PFA puru o 1 ml 10x PBSi o 9 ml vett 2) 1x PBS, 50 ml o 5 ml 10x PBSi o 45 ml MQ3 3) PBS-Tween: 1x PBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50 ml o 5 ml 10x PBSi o 45 ml MQ o 50 μl Tween 4) Permeabiliseerimislahus: 50 mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 1 ml. Raku membraan permeabiliseeritakse ehk muudetakse läbilaskvaks detergendiga (Triton-X-100, saponiin, jt.), et antikehad rakku ja eelkõige rakutuuma pääseksid. See etapp on oluline siis, kui meil on vaja vaadata mingi valgu ekspressiooni raku sees. Kui me vaatame valkguekspessiooni rakupinnal (nt. FACS), siis jätama see etapp vahele. o 50 μl 1M NH4Cl Ammoniumkloriid neutraliseerib jääk-PFA
annaabi.ee 
