on ka kõrgem CO2 sisaldus (5%), mis võimaldab stabiilse pH säilitamise. 91. 92. Teine päev – rakkude paljundamine 93. Esmalt tuleb rakkud vaadelda mikroskoobis, et hinnata nende tihedust ning seisukorda. Rakud ei ole saastanud ega surnud ning nende tihedus on umbes 20%. 1. Pesta rakke 1x PBSiga (PBS on sobiva pH-ga ja osmootset tasakaalu hoidev lahus). Selleks rakkudelt imeda vaakumiga sööde (tassi kallutades), pipeteerida 4 ml PBSi tassi külje vastu, et rakud lahti ei tuleks, loksutada õrnalt ning rakkudelt imeda vaakumiga PBS. PBSiga pestakse rakke selleks, et eemaldada surnud rakud, söötmejäägid ja seerum. 2. Lisada 0,2 ml trüpsiin-EDTA lahust, inkubeerida mitte rohkem kui 5 min. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud ning aitab rakud plastiku küljest lahti saada. Kui liiga kaua inkubeerida hakkab ka raku teisi valke lõikama. Et pärast inhibeerida trüpsiini
150 mM) 0,5 ml 10% Triton-X 100 (lõppkonts. 1%) – detergent, lõhestub bilipiidse membraani 1 ml 50% glütserooli (lõppkonts. 10%) 20 μl 0,5M EDTA (lõppkonts. 2 mM) 3,08 ml MQ-d Panna puhver jääle. Imetajarakkudest valgulüsaadi valmistamine, selleks on vaja: Fuugida põhja trüpsiniseerimisel üle jäänud rakud (3 min 1000 rpm) Eemaldada supernatant Lisada 1 ml PBSi (et eemaldada söötmejäägid), loksutada õrnalt, fuugida uuesti, eemaldada supernatant Asetada rakud jääle, lisada 200 μl lüüsipuhvrit ja 4 μl 50x proteaaside inhibiitorite segu. Korralikult suspendeerida ning asetada epsid rakkudega 30 minutiks +4°C juurde Pärast tsentrifuugida 3 mint, et lahusesse jäid valgud ja sade koosneks membraani komponendidest ja nukleiinhappetest
Meie kasutame vastupidist tehnikat aja kokkuhoiu huvides. c. Rakud elasid tranfektsiooni üle edukalt mikroskoobi all oli näha, et rakkude tihedus oli kasvanud uuesti 100%-ni. d. Transfektsiooni efektiivsus oli umbes 30%. 13. a. Rakkude fikseerimise ja antikehadega märgistamise protokoll: Vajalike lahuste valmistamine: 1. Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10ml. a. 0,4g PFA puru kaaluda väiksesse keeduklaasi b. lisada 1ml 10x PBSi ja 9ml vett c. soojendada magnetsegajal tõmbe all kuni puru on lahustunud. 2. 1xPBS, 50ml. a. 5ml 10x PBS-i. b. Lisada sellele vett (MQ) 50 ml-ni, segada. 3. PBS-Tween: 1xPBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50ml a. 50ml 1xPBS-ile lisada 50 µl 50% Tween-20 lahust, segada. 4. Permeabiliseerimislahus: 50mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 5ml a. 0,25 ml 1M NH4Cl varulahust b. 0,25 ml 10% Triton X-100 c. 0,5 ml 10x PBS-i d. Lisada vett 5 ml-ni, segada (mitte vahtu ajada). 5
annaabi.ee 
