Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi? Ekvivalentne kogus oleks 20 ng (1000bp*100ng/5000bp). Tegelikkuses peaks võtma 3x rohkem ehk 60 ng. 4 Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse. Lähteained: Ligeeritud genoomne DNA (6 l). TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2. E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud (valmistamist vaata lisast) Steriilne LB (lysogeny broth) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl) agar Ampitsilliini (Amp) vesilahus, 100 mg/ml IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus
inserti, et see oleks ekvivalentne(ekvimolaarne) plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi? On vaja võtta 20 ng inserti, et see oleks ekvimolaarne plasmiidiga. Tuleb võtta 60 ng inserti ,kui ligeerimisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi. Insert- see fragment, mida kloonitakse. 3 Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse. Lähteained: Ligeeritud genoomne DNA (6 l). TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2. E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud (valmistamist vaata lisast) Steriilne LB (lysogeny broth) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl) agar Ampitsilliini (Amp) vesilahus, 100 mg/ml IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus
vektori:inserdi suhe on 1:5. Vektor : 5000bp Insert: 1000bp 10ng Kuna suhe peab olema 1:5 50ng Vektor on aga 5 korda pikem kui insert, seega on see ka 5x raskem massi poolest, ehk peame selle 10ng viiega korrutama, et saada reaalse massi. Peame võtma 50ng vektorit. Praktiline töö nr. 6: Transformeerimine Eesmärk: Plasmiidi sisestamine bakterisse selekteerimise ja paljundamise eesmärgil. Materjalid: 5 µl Ligeeritud DNA segu Plasmiid, mis hakkame sisestama 100 µl E.coli kompetentsed Rakud, kuhu sisestame plasmiidi rakud(TOP10), kompetentsuse aste 107 kokku Steriilne tardsööde LB Kus peal oma rakke kasvatame 200ml 200 µl Ampitsilliini vesilahus 100mg/ml Selektsioonimarker 25 µl IPTG 0,8M vesilahus Värvusreaktsioon/Aktiveerib lacZ
annaabi.ee 
