lisamine DNA 3' otsa hüdroksüül-rühma peale. Kasutatakse radioaktiivseks märgistamiseks, kloonimisel (RACE tehnika), et lisada homopolümeersed osad DNA molekuli 3' otsale kloonimiseks. Alkaalne fosfataas ,,BAP": bakteriaalne alkaalne fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Tähtis roll kloonimisel: defosforüülib 5´-fosforüülitud otsa selleks, et takistada vektori ise-ligeerimist. BAP aktiivne 65°C juures for at least 1 h ja seda inaktiveeritakse phenol extraction. Alkaalne fosfataas ,,CIP": fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Hüdrolüüsib NTPd ja dNTPd. Kasutatakse kloonimisel, et vältida korduvat ligeerimist (Aga seda raske väljalülitada, võib häirida ligeerimist). Võib kasutada ka dNTP lõhutamiseks PCR reaktsioonis, et valmistada DNA sekveneerimiseks või SNP
üleulatuvate üheahelaliste sabade, või nn. tömpide otstega DNA fragmendid. Oluline on konverteerida DNA otsad ühendatavateks. Omavahel ühendatavad on kaheahelalise DNA tömbid ja 5' või 3' üheahelalised komplementaarsed DNA otsad. Mittekomplementaarsed üheahelalised osad tömbistatakse ehk täidetakse (Vt. DNA märkimise loengust - Klenowi fragmendi ja T4 polümeraasiga). Kõigi kolme erinevat tüüpi otstega DNA molekulide ühendamiseks kasutatakse ligeerimist s.o. DNA fragmentide ühendamist ligaasi abil. Ligaas katalüüsib kovalentse sideme moodustumist 5'-fosfaat- ja 3'- hüdroksüülrühma vahel. Enamasti kasutatakse T4 DNA ligaasi. Optimaalsete tingimuste korral on inserdi kloonimisse efektiivsus keskmiselt 1:50 st. ühel juhul siseneb insert vektorisse ja 49-l juhul toimub lihtne vektori retsirkulariseerumine. Vektori retsirkularisatsiooni vältimiseks / vähendamiseks ja kloonimise efektiivsuse tõstmiseks on mitmeid võimalusi. 1
47. Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil, vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu: 1 μl puhastatud PCRi produkti 1 μl pSTBlue-1 vektorit (9 ng/μl) 0,5 μl 10x puhvrit 1 μl T4 DNA ligaasi (sünteesib fosfodiester sidemeid) 1,5 μl MQ vett 48. 49.Transformeerimine 50. Eesmärgiks on peale ligeerimist saadud DNA molekuli viimine kompetentsetesse E. Coli bakterisse ja see on oluline selleks, et saaksime kiiresti ja odavalt ning väga väikese vigade hulgaga palju seda plasmiidi (paljundame seda bakteris). Bakterid on eelnevalt töödeldud divalentsete katioonidega (Ca2+, Mn2+), mis muudab rakuseina laengu positiivseks. Plasmiidse DNA lisamisel kinnitub see rakuseinale. Bakteri rakke kuumutatakse lühikest aega ning kuna E
annaabi.ee 
