c) Transformeerimise protokoll: 1. Inaktiveeri ligaas inkubeerides eppendorfi 10 min 65 °C vajalik, et lõpetada vektori ja inserdi ligeerimine ja hoida ära soovimatud ligeerimisprotsessid segus. 2. Transformeerimiseks võta -80°C juurest 10 minutiks jääle sulama kompetentsed rakud. jääs hoidmine on vajalik, kuna külmutatud rakud on väga tundlikud kõrge temperatuuri suhtes. 3. Transformeermiseks võta 20 l kompetentseid rakke ning lisa ligatsioonisegule. 4. Inkubeeri 30 min jääl. vajalik efektiivsuse suurendamiseks keemiliselt kompetentseks muudetud rakkude puhul, kuna külmades tingimustes kinnitub DNA rakuseinale. Etapi võib jätta vahele, või lühendada, kuid see vähendab transformatsiooni efektiivsust. 5. Selle aja jooksul vala LB+Amp+X-gal+IPTG tassid 6. Heat shock: inkubeeri transfornatsioonisegu 90 sekundit 42 oC juures. järsk
Valgete kolooniade puhul sisestatav järjestus rikub lacZ geeni ning muudab sealt kodeeritava ensüümi inaktiivseks, mille tõttu sisestatud DNA järjestusega plasmiide sisaldavad bakterikolooniad ei värvu siniseks. Meid aga huvitavad valged kolooniad. 1. Transformeerimiseks on vaja inaktiveerida ligaas. Seda tegin eppendorfis, inkubeerides 5 min 70 °C juures. 2. Kompetentseid rakke tuleb võtta jääle sulama ning 10 min pärast lisasin 20 μl rakke ligatsioonisegule. Kogu segu inkubeerisin 30 min jääl. Meie kasutasime DH5α, mille kompetentsus on 107 (see tähendab, et 1 ng-ga transformeeritud tass annab 107 kolooniat) 3. Selle aja jooksul valatakse LB + Amp + X-gal + IPTG tassid: jälle sulatatakse agarsöödet (200 ml) ning pärast 50 °C-ni jahtumist lisatakse 200 μl X-gal, 200 μl ampitsiliini ning 25 μl IPTG-d. Pärast segamist valasin homogeenne sööde õhukese kihina Peetri tassile, kus ta jäi mõneks ajaks tarduma. 52
Inaktiveerisin ligaasi, 10 min 5 juures. jooksul 70 C Võtsin -80 C 5 juurest 10 min jääle sulama komptentsed rakud Võtsin 20 µl rakke ja lisasin ligatsioonisegule ja inkubeerisin 30 min jääl Teostasin Heat shocki: inkubeerisin 90 sek väitel 42 C 5 juures transfoneeritud segu, kohe tõstsin 2 minutiks jääle (membraaniaugu sulegemiseks) Lisasin segule 500 µl vedelsöödet ja panin inkubeerima 30 min-ks inkubeerima 37 C 5 juures (et rakud jaguksid) Tsentrifugeerisime bakterid põhja 3000 rpm 2 min ja rakupeal olev sööde valasin kraanikaussi
annaabi.ee 
