2µl PEI-d). DNA:PEI suhe sõltub rakuliinist, vaja optimiseerida. 25 µl DMEM + pEGFP (250 ng/µl), 500 ng = 2 µl. 25 µl DMEM + pEGFP/FoxO3a (1000 ng/µl) 500 ng = 0,5 µl. 2x = 25 µl DMEM + 2x1 = 2 µl PEI lahust 3. Jagada DMEM+PEI segu võrdselt DNA segudele (26 µl kaupa), segada läbi, tsentrifuugida ja inkubeerida 10-15 minutit toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja transfektsioonireagendi PEI kompleksid, lahus muutub häguseks. 4. Tõsta katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. 5. Pipeteerida transfektsioonisegud klaasidele. Aja kokkuhoiu mõttes jätsime meie ära tsentrifuugimise ning pipeteerisime transfektsioonisegu kohe klaasile ning alles seejärel inkubeerisime 15 minutit. Rakkude külvamine 24-augulisele plaadile 6. Rakkude vaatlemine mikroskoobis. Rakkude tihedus umbes 100% 7. Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga , PBS ära imeda. 8
Rakkude tihedus on umbes 95%. 1. Transfektsioonisegu ettevalmistamine. Võta 3 1,5 ml epsi. Esimeses segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFPd. Teises segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a Kolmandas segada 50 μl DMEMi ja 2 μl PEI lahust. 2. Jagada segu kolmandast epsist võrdselt DNA segudele (26 μl kaupa), segada läbi, fuugida ja inkubeerida 10-15 min toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja PEI kompleksid, lahus muutub häguseks. 3. Tõsta katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. Pipeteerida oma transfektsioonisegud klaasidele. 4. Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga, PBS ära imeda. Lisada 0,2 ml trüpsiin-EDTA lahust, inkubeerida mitte rohkem kui 5 min. Lisada 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS NB! antibiootikumideta, kuna koos teiste reagentidega võivad need muutuda rakkudele toksiliseks), suspendeerida rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti. 5
On näidatud, et valgu madal ekspessioon on seotud tumorgeneesiga. • Kolmandas epsis segada 50 μl DMEMi ja 2 μl PEI lahust Pärast agada segu kolmandast epsist võrdselt DNA segudele (52:2=26 μl kaupa), segada, fuugida ja inkubeerida 15 min toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja PEI kompleksid ja lahus muutub häguseks. Tõstsin katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. Pipeteerisin transfektsioonisegud klaasidele. Rakkudelt imesin vaakumiga sööde ja pestsin 1 ml PBSiga. Lisasin 0,2 ml trüpsiin- EDTA lahust, inkubeerisin 5 min. Lisasin 1 ml DMEM + 10% FBS, seekord ilma antibiootikumideta, et vältida antibiootikumi reaktsiooni teiste komponentidega ja kõrvaldada nende toksilisuse riski, suspendeerisin rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti.
annaabi.ee 
