Lõikan skalpelliga geelist enda fragmendi välja. (0,15g) Lisan ADB puhvri geelile. Inkubeerime 55kraadi juures 5minutit, kuni geel on täielikult sulanud. Pipeteerin kogu koguse ränikolonni. Tsentrifuugin – DNA jääb räni külge ja ülejäänud puhvri viskan ära. Pipeteerin peale 200 µl pesupuhvrit, tsentrifuugin ja kordan. Tõstan kolonni puhtasse 1,5ml tuubi. Elueerin DNA kolonnist elueerimispuhvri abil. Inkubeerin paar minutit laua peal Tsentrifuugin 1 minuti. Seejärel on tuubi põhjas elueerinud PCRi produkt lahustatune elueerimispuhvris. Kontrollimiseks segan kokku 2 µl eluaati, 6,33 µl MQ ja 1,66 µl 6x värvi. Tsentrifuugin ja kannan geelile. Geeli pilt tulemuste all. Tulemus: Minu rada nr8. Miks on vaja PCR produkti puhastada? Tahame vabaneda kõigest üleliigsest lahuses, nätieks praimeritest,
Taq DNA polümeraas, 5 u/l (Fermentas) 2 mM dNTP (Fermentas) T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/l Töö käik: A: Restriktsioon (1) Restriktsioon: 1) 20 µl plasmiidsed DNA-d 22 µl 2) 2 µl 10x restriktaasi puhvrit Saadud 22 µl lahust jagan kaheks tuubiks, mõlemad 11 µl. Ühele tuubisse lisan 1 µl Cfr 421, teisele ei lisa, see on kontroll proov. Mõlemad tuubid inkubeerin 37 kraadi juures 1 tund. (2) Analüüsi saadud restriktsioon 0,8% 1 x TBE- agaroos-geelil (valmistamist vt eelmine praktikum). Iga üliõpilane kannab geelile kaks rada: kontroll ja restriktsioon: selleks lisada mõlemasse tuubi 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhvrit (lilla). Ühisele geelile tuleb lisada ka molekulmassi marker DNA, mille abil on võimalik määrata inserdi suurust ja kui võimalik standard DNA, mille abil saab määrata uuritava DNA kogust. 9 B: PCR
inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml – eemaldab bakteriaale RNA prepsist). Lisasin 0,2 ml E2 lahus(0,2 N NaOH, 1% SDS – detergent, lõhustab bakteriraku membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima. Kuna plasmiidne DNA on tsirkulaarne, siis ahelad ei eralduvad), suspendeerisin. Inkubeerin laua peal 5 minutit. Lisasin peale 0,2 ml E3 lahus(5 M KOAc – peatab lüüsi, mille tagajärjel valgud ja genoomne DNA sadenevad välja. Reageerib SDS-da, tekitades ka mittelahustava sadet. 10% äädikhape pH normaliseerimine. Plasmiid DNA renatureerub ja asub nüüd supernatandis, ulejäänud – sade.) ja raputasin kuni see täesti ühtlane
annaabi.ee 
