kohta. Kui 1 ng-ga transformeeritud tass annab 100 kolooniat, siis 1µg annab 100 000 (mis on suhteliselt viletsad). Head kompetendid on näiteks 10 8, see tähendab, et 1ng- ga transformeeritud tass annab 100 000 kolooniat, mida on ilmselgelt ülelugemiseks liiga palju, siis kasutatakse transformeerimisel veel väiksemaid koguseid (juba 10pg plasmiidiga transformeerimisel tekib 1000 kolooniat). c) Transformeerimise protokoll: 1. Inaktiveeri ligaas inkubeerides eppendorfi 10 min 65 °C vajalik, et lõpetada vektori ja inserdi ligeerimine ja hoida ära soovimatud ligeerimisprotsessid segus. 2. Transformeerimiseks võta -80°C juurest 10 minutiks jääle sulama kompetentsed rakud. jääs hoidmine on vajalik, kuna külmutatud rakud on väga tundlikud kõrge temperatuuri suhtes. 3. Transformeermiseks võta 20 l kompetentseid rakke ning lisa ligatsioonisegule. 4. Inkubeeri 30 min jääl
III.Ksüleeni immutamine IV. Paraffiini sisestamine Fikseerimine kindlustab kudedes toimuvate surmajärgsete muutuste ärahoidmise ja aitab kaasa tervikliku struktuuri säilitamisele. Selleks, et koetükki hüdrofoobsesse paraffiini panna, tuleb seda enne hüdrofoobsesse lahustisse immutada ehk kõigepealt hüdrofiilsest veest lahti saada. Seega, järgmiseks etapiks on koe etanooliga veetustamine ehk vee eemaldamine kude kasvavas etanooli gradiendis (50-100% etanooli) inkubeerides. Järgmisena, etanool asendatakse hüdrofoobsema lahusti ksüleeniga. Ksüleen on hüdrofoobne lahus, mis seguneb nii paraffiini kui ka etanooliga. Ja alles pärast ksüleeniga immutamist kude võib sulanud paraffiini sisestada. Pärast paraffiini tardumist kude lõigatakse õhukesteks lõikudeks, mis pannakse alusklaasile ja edasi värvitakse. 2. Elusrakkude värvimise põhietapid (iga etapi eesmärk). Rakkude fikseerimine on rakupreparaadi kinnitamine alusklaasile nii, et edasise
bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, mis dimeriseerumise ja oksüdeerimise tagajärjel annab sinist värvi) sinist pigmenti – kolooniad on sinised. Valgete kolooniade puhul sisestatav järjestus rikub lacZ geeni ning muudab sealt kodeeritava ensüümi inaktiivseks, mille tõttu sisestatud DNA järjestusega plasmiide sisaldavad bakterikolooniad ei värvu siniseks. Meid aga huvitavad valged kolooniad. 1. Transformeerimiseks on vaja inaktiveerida ligaas. Seda tegin eppendorfis, inkubeerides 5 min 70 °C juures. 2. Kompetentseid rakke tuleb võtta jääle sulama ning 10 min pärast lisasin 20 μl rakke ligatsioonisegule. Kogu segu inkubeerisin 30 min jääl. Meie kasutasime DH5α, mille kompetentsus on 107 (see tähendab, et 1 ng-ga transformeeritud tass annab 107 kolooniat) 3. Selle aja jooksul valatakse LB + Amp + X-gal + IPTG tassid: jälle sulatatakse agarsöödet (200 ml) ning pärast 50 °C-ni jahtumist lisatakse 200 μl X-gal, 200 μl ampitsiliini ning 25 μl
annaabi.ee 
