3) Marker suuruse määramiseks 4) Proov 1 5) Proov 2 6) PSA kontsentratsiooni määramiseks 100 µg/µl 7) 250 µg/µl 8) 500 µg/µl · Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. Geel 1 2 M 1 2 100 250 500 · Pärast elektroforeesi toimumist võtame geeli välja ja lõikame ülemise osa ära. Alumise osa lõikame markeri keskelt pooleks- väiksem osa läheb immunoblotti ja suurem osa värvimiseks. Geeli värvimine · Suurema osa geeli värvime seguga: 25% isopropanool, 7% äädikhape, 0,1% Commasie Blue R. · Laseme seista üleöö. · Järgmisel päeval peseme 7% äädikhappega, kuni lilla värv on geelilt eemaldunud (valgud hoiavad värvi tugevamalt kinni kui geel).
· Kui geel on tardunud võtame ,,kamm" ära, seejärel võtame klaasid ära ja paneme geelid freesi vanni. Lisame vanni ,,Running ,,puhvrit. · Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1; 2;M; 1; 2; 0,5; 1; 1,5; · Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. Geel 1 2 M 1 2 0,5 1 1,5 · Pärast elektroforeesi toimumist võtame geel välja ja lõikame pooleks. Väiksem osa läheb immunoblotti ja suurema osa värvime. Geeli värvimine. · Suurema osa geeli värvime seguga: 25% isopropanool, 7% äädikhape, 0,1% Commasie Blue R. · Laseme seista üleöö. · Järgmisel päeval võtame geelid lahusest ära ja pildistame neid.
Kõrge tundlikkuse annab antigeen-antikeha vaheline immunoloogiline reaktsioon. SDS denatureerib valgud, st säilivad lineaarsed epitoobid, konformatsioonilised kaovad. Kliinilises diagnostikas on immunobloti kasutamine piiratud, sest ta on aeganõudev ja raskelt automatiseeritav. 100% puhaste antigeenide kasutamine iseloomustab ELISA meetodit, immunoblott võimaldab aga analüüsida nn musti antigeene. Immunoblotti kasutatakse referentstestina mitmete nakkushaiguste serodiagnostikas (HIV, H. pylori, Borrelia burgdorferii). Skriinimiseks immunoblott ei sobi. Veel kasutatakse seda meetodit autoantikehade määramiseks (tuumaantikehade leiu diferentseerimiseks, ENA- Extractable Nuclear Antigens- antikehad), teaduslikes eksperimentides haiguste patogeneesimehhanismide selgitamisel, autoantigeenide kindlakstegemisel, molekulaarbioloogias.
annaabi.ee 
