S sidumisel nihkub tasakaal R-oleku kasuks. III VALKUDE UURIMISE MEETODID 1. Tsentrifuugimine, diferentsiaal ja gradientfuugimine. Tsentrifuugimisega on võimalik eraldada osakesed, mis erinevad massi või tiheduse poolest. Suurendades tsentrifuugi kiirust on võimalik katseklaasi põhja viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine teostatakse saharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograafia, hüdrofoobsuskromatograafia, geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia. Vedelikkromatograafias toimub eraldamine valgumolekulide erinevaid füüsikalis-keemilisi omadusi kasutades. Ioonvahetuskromatograafia eraldamine vastavalt valkude laengule.
reguleerimist, seondudes efektormolekulile valgu allosteerilises saidis (see tähendab kohta, mis pole valgu aktiivsait). VALKUDE UURIMISMEETODID 1. Tsentrifuugimine, diferentsiaal ja gradientfuugimine Tsentrifuugimisega on võimalik eraldada osakesed, mis erinevad massi või tiheduse poolest. Suurendades tsentrifuugi kiirust on võimalik katseklaasi põhja viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine – kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine – teostatakse sahharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograagia, hüdrofoobsuskromatograafia,geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia Kromatograafia on laboritehnika molekulide eraldamiseks. Eraldab molekule nt valke, mis on jaotunud mobiilse ja stratsionaalse faasi vahel. Eluaat on mobiilne faas, mis liigub mingis kindlas suunas
NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri (http://geen.ttu.ee/?id=10705, vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine). Töö käik: 6 (1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid asetada tsentrifuugi nii, et tuubi ja kaant ühendav osa jääks väljapoole. Tuubi selline asetus on vajalik selleks, et pärast fuugimist meile oleks selge kus kohas tuubis on sade. (2) Eemalda supernatant sademe vastaspoolelt (ülemine vedeliku kiht, vt allpool olevalt skeemilt) (maksimaalselt!) ja suspendeeri bakterimass 200 l Lahuses I. Sega hoolikalt (vortex), et tekiks ühtlane suspensioon. Kasuta vajadusel pipetti. Suspensiooni tegemiseks segame, kas näpu, Vortexi või puutikkuga. (3) Lisa 400 l lahust II (rakud lüüsuvad, valgud ja nukleiinhapped denatureeritakse),
söödet. 3. Võtta külmast krüoviaaliga rakud (NIH3T3 – hiire embrüonaalsed fibroblastid) ja sulatada kiirelt (tegin seda käes), kuna külmutussegi sisaldab DMSO-t, mis on soojana rakkudele toksiline. 4. Järgmisena võtta 15 ml tuubist automaatpipetiga 0,5 ml sooja söödet ja lisada viaali, tõsta rakud 15 ml tuubi ringi. Fuugida rakud põhja 5 min 1000 rpm toatemperatuuril (kuna rakud on õrnad, kiirus ei tohi olla üle 1000 rpmi). 5. Pärast fuugimist tuleb tõmmata vaakumpumbaga sööde rakkudelt, kasutades Pasteuri pipeti ning steriilset otsikut. 6. Tuubile rakkudega lisada 0,5 ml söödet (6 cm tassilt), suspendeerida ning panna tagasi tuubist tassile. Teha tassiga 8-kujulisi liigutusi, et rakud tassil ühtlaselt jaotuksid ning asetada oma tass CO2 inkubaatorisse. 90. Enamus rakuliine vajab kasvamiseks temparatuuri 37 °C ja pH-d vahemikus 7,2 – 7,4. Selliste
annaabi.ee 
