1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24486593 Inimese FoxO3a ekspressiooni vähenemine põhjustab neerurakkudes kartsinoomi teket ja kasvajarakkude metastaasi. 2. Pikkus 7341 aluspaari, paikneb kuuendas kromosoomis, lookuses NM_201559. Komponendid: 176-178 upstream in-frame stopp-koodon, arvukalt fosforüleerimis- ja metüleerimissaite, 1040-1093 tuumalokalisatsioonisignaal, 7320-7325 ja 7341 polüadenüleerimissait. 3. Pikkus 124,947 aluspaari, paikneb kuuendas kromosoomis, vahemikus 108 559 823- 108 684 769
Lisaks lisasin juhendist erinevalt ühte auku 20 l, ning pipeteerisin uue puhta broomfenoolsinise kuuendasse auku. Tulemuseks oli küllaltki sujuv värvirida. Blotipaberile oma nime ja mustrit pipeteerides jälgisin, et pipett ei läheks liiga sügavale lahusesse, et pipett oleks otse ning pipeteerimine toimuks sujuvalt, et kogused oleks võimalikult täpsed ning täpid tuleksid ühtlased. 1. Polümeraasi ahelreaktsiooni teostamine a) Paljundamiseks sain plasmiidi pEGFP-FoxO3a-wt, praimeritest kasutasin: · EGFP-3-s-170-F (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3') · SV40p-R (5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3') Praimerid on valitud selliselt, et nad ei moodustaks omavahel dimeere (ehk ei oleks omavahel komplementaarsed) ning oleksid komplementaarsed lõiguga paljundataval DNA-l, millega praimerid seonduvad ning kust algab replikatsioon. b) Kasutatud PCR-i programm: 1. 95 o C 15 minutit ensüümi (polümeraasi) aktiveerimiseks 2
19. PCRi kasutatakse valitud DNA lõigu paljunadamiseks. Väga tähtis moment reaktsiooni teostamisel on õigete praimerite valimine ning reaktsioonitingimuste kindel täitmine. PCR reaktsioon toimub kolme-etapiliselt: DNA ahelate denatureerimine, praimerite seondumine DNA ahelatega ning DNA süntees. 20. Oma töös kasutasin Reverse (vastassuunilise) praimerina SV-40 poly A, Forward (pärisuunalise) praimerina EGFP-3-170, ning plasmiidina pEGFP-FoxO3a-wt. Oodatav produkti pikkus – 2400 aluspaari. 21. Töö käik: 1. Pipeteerisin kokku PCRi reaktsioonisegu (20μl): 11,3 μl vett 2 μl 10x polümeraasi puhvrit – tagab vajalikud reaktsioonitingimused, nagu pH, soolade kontsentratsioon jt μl 25 mM MgCl2 (lõppkonts. 2,5 mM) – Mg2+ ioonid on vajalikud polümeraasi töötamiseks 2,4 μl 2 mM dNTP (lõppkonts. 240 μM) – sisaldab 4 liiki nukleotiide
Rakkude tihedus on umbes 90%. Transfektsioonisegu ettevalmistamine: Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI. • Esimeses epsis segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFP-C1d (250 ng/μl) kontrollplasmiid – sisaldab pEGFP, ehk kui transfekteerimine õnnestub, rakud peavad flouriseerima flouristent mikroskoobi all. • Teises epsis segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a (conc 1000 ng/μl) uuritav konstrukt. Ehk plasmiidid, mis korrefivad EGFP ja, mis sisaldab FoxO3a geeni kodeeriva järjestuse. FoxO3a on transkripstiooni faktor, valk on reguleerib apoptoosi ja kaitseb raku oksüdatiivse stressi eest. On näidatud, et valgu madal ekspessioon on seotud tumorgeneesiga. • Kolmandas epsis segada 50 μl DMEMi ja 2 μl PEI lahust
annaabi.ee 
