Kokaraamatus lisatakse lahust I 100 µl, me lisasime lahust I 200µl. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RNaasA-d, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5ng/µl 1 ml- s TE- s. Tuleb lahjendada RNaasi 2000 korda. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga. Geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni elektroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? EtBr on vajalik elektroforeesil, et visualiseerida meie tulemused ehk selleks, et elektroforeesi pildil oleks võimalik eristada meie inserdi erinevaid osasid. Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada.
3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused? Punktis 7 pestakse lahust 70% etanooliga. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RnaasA-d, 2000x. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga, tuleb asetada eletroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? DNA nähtavaks tegemiseks (EtBr interakteerub lämmastikaluste vahele ning hiljem UV-valguses fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks). 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1
73 5. Kui agaroosilahus on jahtunud umbes 55ºC- ni, lisa EtBr lahust ning vala geel alusele. NB! Kasutades plastikust geelialuseid on oluline jälgida, et geelilahuse temperatuur langeks alla 60°C. Kuumemad lahused lõhuvad geelialuse. Vala aeglaselt ja väldi õhumullide teket geelis. 6. Oota kuni geel on täiesti tardunud, eemalda ettevaatlikult kamm ja geelialuse otstest teip. Aseta geel foreesivanni. 7. Lisa foreesipuhvrit, et see kataks geeli umbes 2-3 mm. 8. Lisa DNA proovile umbes 0,2 mahu ulatuses värvainet (loading dye). 9. Kanna proov aeglaselt hambasse. Kindlasti kanna geeli äärmistele radadele ka suurusmarker. 10. Sule foreesivann kaanega ja lülita vool sisse. Voolupinge peaks olema 1-5 V/cm (distants positiivse ja negatiivse elektroodi vahel). Elektroodi juurest hakkab eralduma mulle ja broomfenoolsinine liigub mõne minuti jooksul hambast geeli
annaabi.ee 
