(3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. Tegime 15 tsüklit. (5) Samal ajal valmista 1,2% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda 0,6 g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). 12 Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). PCRi tulemused. Marker 100 bp pBS SK+ Kristine
(3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. (5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). Restriktsiooni tulemused: Minu minipreparatsioonis tuli välja 2 inserti. Üks umbes 2,5 kb pikkune ja teine umbes 6 kb pikkune.
73 5. Kui agaroosilahus on jahtunud umbes 55ºC- ni, lisa EtBr lahust ning vala geel alusele. NB! Kasutades plastikust geelialuseid on oluline jälgida, et geelilahuse temperatuur langeks alla 60°C. Kuumemad lahused lõhuvad geelialuse. Vala aeglaselt ja väldi õhumullide teket geelis. 6. Oota kuni geel on täiesti tardunud, eemalda ettevaatlikult kamm ja geelialuse otstest teip. Aseta geel foreesivanni. 7. Lisa foreesipuhvrit, et see kataks geeli umbes 2-3 mm. 8. Lisa DNA proovile umbes 0,2 mahu ulatuses värvainet (loading dye). 9. Kanna proov aeglaselt hambasse. Kindlasti kanna geeli äärmistele radadele ka suurusmarker. 10. Sule foreesivann kaanega ja lülita vool sisse. Voolupinge peaks olema 1-5 V/cm (distants positiivse ja negatiivse elektroodi vahel). Elektroodi juurest hakkab eralduma mulle ja broomfenoolsinine liigub mõne minuti jooksul hambast geeli. Forees kestab seni kuni värvid
annaabi.ee 
