• 40 μl 2% BSA lahust • 60 μl 1x PBS-Tweeni • Goat anti mouse 1:2000 Alexa568 (punane värv) 0,2 μl • Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Sekundaarse antikeha valikul tuleb jälgida, millises loomas on tehtud primaarne antikeha. Sobiv fluorokroom tuleb valida selle järgi, milliseid teisi fluorokroome veel samal preparaadil kasutate. Praktikas kasutatakse korraga tavaliselt 2-3 antikeha, on võimalik ka rohkem. Fluorokroomid on üldiselt tundlikud valguse suhtes, sellepärast on vajalik ka neid liigse valguse eest kaitsta. • Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga • Pesta 1 kord 1 ml MQga Alusklaasidele panemine ehk sulundamine, selleks on vaja: • Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Sulundamislahus “kleebib” rakku
anneksiin viie (anneksiin-V) abil. Fluorestsentsmärgisega anneksiin-V seondub kaltsiumi juuresolekul fosfatidüülseriiniga, märgistades sel viisil apoptootilisi rakke. Kuna fosfatidüülseriin muudab oma orientatsiooni juba apoptoosi algetapis, võimaldab anneksiin-V-ga märgistamine tuvastada just varajases apoptoosis olevaid rakke. Hilises apoptoosis olevaid rakke saab tuvastada membraani läbilaskvuse meetodiga. Selleks kasutatakse DNAga seonduvaid fluorestsentsvärve (DAPI). Fluorokroomid ei pääse tervest rakumembraanist sisse, kui apoptoos on toimunud piisavalt kaua, muutub membraan auklikuks ja värv pääseb sisse ja seostub DNAga. TUNEL assay – TdT- meditated dUTP Nick-End Labeling – apoptootilisi tuumi saab tuvastada
konstrueerida sondi perekonna, liigi, isegi teatud geeni eristamiseks (näiteks virulentsust või RR determineerivat). Hübriidi moodustanud nukleotiidahelaid peab olema võimalik avastada ja eristada nukleiinhappe mittehübridiseerunud lõikudest. Selleks kasutatakse diagnostilist reporter-molekuli ehk märgistatud DNA või RNA (moodustabki sondi!), mis on kas: • radioaktiivsed (32P, 125I, 35S) või • mitteradioaktiivsed (biotiin-avidiin, digoxigeniin,fluorokroomid). Radioaktiivselt märgistatud sondide kasutamine kliinilises diagnostikas on komplitseeritud. Rohkem on kasutamist leidnud biotinülatsioon, mida on võimalik avastada avidiinile seotud ensüümi lisamisega. Hübriidi sedastatakse kromogeense substraadi lõhustamise käigus toimuva värvusreaktsiooni abil, mida hinnatakse visuaalselt või spektrofotomeetriliselt. Kemiluminestsentsi kasutatakse kommertsiaalses süsteemis Gen-Probe. ÜHEAHELALISE SIHTMÄRK-DNA VÕI -RNA VALMISTAMINE
annaabi.ee 
