TEMED – 4 µl tõmbekapi all APS – 40 µl 4. Valasime kontsentreeriva geeli lahutava geeli peale, eelnevalt kontrollides lahutava geeli polümeseerimist, ning ettevaatlikult panime paika kammi. Jätsime geel polümeriseeruma. Vlaguproovide valmistamine: 1. Segasime omavahel valgulahus ja 2x laadimispuhver, mille komponendiks on broomfenoolsinine – värv, mis aitab jälgida proovide migreerumist (15 µl valgulahus + 15 µl laadimispuhvri) eppendorfis. 1. Trüpsin 23,8 kDa 2. EPGluC 29 kDa 3. Laktaat dehüdrogenaas 35 kDa 4. HRP 44 kDa 5. Ovalbumiin 44,3 kDa 6. BSA 66,3 kDa 7. Tundmatu valk X kDa 2. Inkubeerisime denatureerimiseks 95oC juures 5 minutit. 3. Jahutasime valguproovid jäävannis. 4
12. Pese sadet sooladest vabanemiseks 70% etanooliga. See tähendab: pipeteeri sademele 200l 70% EtOH, tsentrifuugi 5 minutit maksimumpööretel RT ning eemalda supernatant. Etanool lahustab sademest üles DNAga kaasa tulnud mitmesuguseid soolasid. Ettevaatust! Jälgi et DNA sade etanooli äravõtmisel kaasa ei tuleks! 13. Kuivata DNA sade läbipaistvaks, et vabaneda ka etanooli jääkidest. kuivatamise kiirendamiseks panime eppendorfis +37 kraadi inkubaatorisse 14. Suspendeeri 30-50 l MQ-s DNA sade lahustus kiiresti d. Edukaks DNA eralduseks peab olema transformatsioon edukas ning kasutatavate lahuste kogused ning tsentrifuugimise ja inkubeerimise ajad olema optimaalsed, igasugune kõrvalekalle vähendab saagist või eraldatud DNA puhtusastet. Saagise kogust mõjutavad tegurid: i. rakkude vedelsöötmes kasvatamise aeg (optimaalne on 16h, kui
bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, mis dimeriseerumise ja oksüdeerimise tagajärjel annab sinist värvi) sinist pigmenti – kolooniad on sinised. Valgete kolooniade puhul sisestatav järjestus rikub lacZ geeni ning muudab sealt kodeeritava ensüümi inaktiivseks, mille tõttu sisestatud DNA järjestusega plasmiide sisaldavad bakterikolooniad ei värvu siniseks. Meid aga huvitavad valged kolooniad. 1. Transformeerimiseks on vaja inaktiveerida ligaas. Seda tegin eppendorfis, inkubeerides 5 min 70 °C juures. 2. Kompetentseid rakke tuleb võtta jääle sulama ning 10 min pärast lisasin 20 μl rakke ligatsioonisegule. Kogu segu inkubeerisin 30 min jääl. Meie kasutasime DH5α, mille kompetentsus on 107 (see tähendab, et 1 ng-ga transformeeritud tass annab 107 kolooniat) 3. Selle aja jooksul valatakse LB + Amp + X-gal + IPTG tassid: jälle sulatatakse agarsöödet
annaabi.ee 
