nimetatakse sarnast protsessi transformatsiooniks). Viiruste abil DNA üle kandmist nimetatakse transduktsiooniks. Keemilised meetodid tekitatakse DNA-reagent kompleks: · Kaltsiumfosfaat tekitatakse kaltsiumfosfaat-DNA sade, mis lisatakse rakkudele, avastati 1973, hea odav, probleemiks efektiivsus. · katioonsed polümeerid (PEI-polüetüleenimiin, DEAE dekstraan) - soodustavad DNA seostumist membraaniga ja endotsütoosi, puuduseks toksilisus. · dendrimeerid suured hargnevad polümeerid, mis seovad DNA-d. · liposoomid ja katioonsed lipiidid (näit. Lipofectamine) fuseeruvad membraaniga, suhteliselt efektiivne, vähe toksiline, probleemiks hind. Füüsikalised meetodid. · elektroporatsioon rakule tehakse elektrisokk, mille tulemusel tekivad membraani väikesed avad ja DNA siseneb rakku. Tapab osa rakke maha. · sono-poratsioon ultraheliga · optiline transfektsioon laseriga tehakse raku membraani auk, kasulik üksikute
118. Eesmärgiks on tutvustada transfektsiooni meetodit uuritava valgu ekspresseerimiseks loomarakus. 119. Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Plasmiidi sisseviimiseks peavad rakud ennast hästi tundma ja paraja tihedusega olema (reeglina 50-70%). 120. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni) kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad
kalibreerimiskõvera järgi. Kalibreerimiskõver ise ehitatakse standaarse valgu järgi (lahjendusterea järgi), kus x teljel on kontsentratsioonid ja y teljel on mõõdetud optilise tihedus. Figure 2 illusteeriv pilt 4. Praktikum - transfektsioon Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). Meie majas on kasutusel ka Amaxa Nucleofector –aparaat, mis kombineerib elektroporatsiooni ja keemilisi transfekteerimise meetodeid. Võimaldab efektiivsemalt transfekteerida rakke, mis muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab:
annaabi.ee 
