c. soojendada magnetsegajal tõmbe all kuni puru on lahustunud. 2. 1xPBS, 50ml. a. 5ml 10x PBS-i. b. Lisada sellele vett (MQ) 50 ml-ni, segada. 3. PBS-Tween: 1xPBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50ml a. 50ml 1xPBS-ile lisada 50 µl 50% Tween-20 lahust, segada. 4. Permeabiliseerimislahus: 50mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 5ml a. 0,25 ml 1M NH4Cl varulahust b. 0,25 ml 10% Triton X-100 c. 0,5 ml 10x PBS-i d. Lisada vett 5 ml-ni, segada (mitte vahtu ajada). 5. Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2ml a. 0,04 g BSA-d b. 0,02 ml 10% NaN3 c. Lisada 1xPBS-i 2ml-ni. I Fikseerimine 1. Rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde 2. Rakud fikseerida 0,5 ml 4% PFAga PBSis, inkubeerida 15 minutit toatemperatuuril. 3. Pesta rakke 3 korda 5 minutit á 1 ml 1x PBSiga. II Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine 1. Lisada rakkudele á 0,5 ml 50mM NH4Cl + 0,5% Triton X-100 PBSis, inkubeerida 15 minutit toatemperatuuril. 2. Pesta rakke 2 korda 5 minutit á 1 ml 1x PBSiga.
146. 0,4 g PFA puru + 1 ml 10x PBSi + 9 ml vett 1x PBS, 50 ml 147. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ, segada PBS-Tween: 1x PBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50 ml 148. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ + 50 μl Tween 20 Permeabiliseerimislahus: 50 mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 1 ml 149. 50 μl 1M NH4Cl + 50 μl 10% Triton X-100 + 100 μl 10x PBSi + 800 μl MQ Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml (oli valmis) 150. 0,04 g BSA-d + 20 μl 10% NaN3 + 1,98 ml MQ 151. 152. 2. Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 3. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust
See etapp on oluline siis, kui meil on vaja vaadata mingi valgu ekspressiooni raku sees. Kui me vaatame valkguekspessiooni rakupinnal (nt. FACS), siis jätama see etapp vahele. o 50 μl 1M NH4Cl Ammoniumkloriid neutraliseerib jääk-PFA o 50 μl 10% Triton X-100 - detergent, mis lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks. o 100 μl 10x PBSi o 800 μl MQ 5) Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml. o 0,04 g BSA-d o 20 μl 10% NaN3 NaN3 kasutatakse konservandina (takistab bakterite elutegevust). Väga toksiline aine. o 1,98 ml MQ Fikseerimine: • rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde • lisada 0,5 ml fikseerimislahust. PFA tekitab kovalentsete sidemete võrgustiku säilitades valkude ja DNA asukoha rakus ning seeläbi jääb püsima ka raku kuju. Rakud ei lagune,
annaabi.ee 
