võimatuks. Väga pikkade fragmentide sekveneerimiseks kasutatakse forward ja reverse praimereid, kuid eraldi reaktsioonides. Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik: Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami! Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada. Ümberkloneerimist ei saa teha vaid ühte restriktaasi kasutades, kuna pärast me
kvaliteediga, keskmise osa kvaliteet oli küllaltki hea, piigid joonistusid selgelt välja ning olid loetavad. ii. Sekveneeritud sai terve sisestatud insert. iii. Järjestuses on tekkinud üks punktmutatsioon, kus A on muutunud C-ks. See muudab ka aminohapet E asemel sünteesitakse A. 8.a) Kloneerimiseks tuleb vektorit ja inserti lõigata, tekitades komplementaarsed kleepuvad otsad, seejärel tuleb otsad kokku ligeerida. i. Restriktaasidest võiks kasutada EcoRI ja BamHI-d, et saada vektorile ja inserdile sobivad ,,kleepuvad otsad". Ainult EcoRI-st ei piisa, kuna inserdil on vaid üks EcoRI lõikamissait ühte otsa tuleb töödelda mingi teise restriktaasiga, BamHI sobib kõige paremini, kuna lõikab pärast kodeerivat järjestust. Kuna inserdi algus ja lõpp on erineva restriktaasiga lõigatud, siis see kindlustaks ka selle, et insert siseneb vektorisse õiget pidi
Aor51HI agc|gct none ApaI gggcc|c none ApaLI g|tgcac none AscI gg|cgcgcc none AseI at|taat 750 Asp718I g|gtacc none AsuII tt|cgaa none AvaI c|ycgrg none AviII tgc|gca 15, 372, 567 AvrII c|ctagg none BalI tgg|cca none BamHI g|gatcc none BanIII at|cgat 980 BbeI ggcgc|c none BbrPI cac|gtg none BbuI gcatg|c none BcuI a|ctagt none BclI t|gatca none BfaI c|tag none BfrI c|ttaag none BfrBI atg|cat none BglII a|gatct none BlnI c|ctagg none BseCI at|cgat 980 BsePI g|cgcgc none
annaabi.ee 
