juures (et rakud jaguksid) Tsentrifugeerisime bakterid põhja 3000 rpm 2 min ja rakupeal olev sööde valasin kraanikaussi Meie huvipakuvad bakterid nüüd sisaldavad ampitsiliiniresistentsus geeni ja ei sisalda glaktosidaasi – see on meie selektsiooni põhimõtte. Nüüd tuleb neid paljundama ja selekteerida. Selleks paneme neid kasvama sööde peale. Valmistasime söödet, kuhu panime ampitsiliini (antibiootikumi toimel surevad ära kõik ilma plasmiidita bakterid) ja X-gali, mis on laktoosi analoog, vaid glükoosi asemel on indool, mis vabaneb glükosiidsideme hüdrolüüsi käigus, ning oksüdeerub ja värvub siniseks. Sööde valmistamiseks: Sulutasime LB(steriilne sööde)+Agar söödet mikrolaineahjus sulemiseni, jahtusime pidavlt segades (et ei tarduks ära) ~50 kraadini.
Kannan bakterisegu Petri tassile. Kallan klaasterad tassile ja loksutan et bakterid laiali kanduksid. Asetame tassid 37 kraadi juurde kasvama . Mida ja miks me transformeerime? Millist tulemust ootad? Viime enda vaheplasmiidi bakterisse, et see paljuneks ja et tekiksid kolooniad. Vastavalt valged ja sinised. Meie tahame valgeid kolooniaid saada. Milleks lisasime antibiootikumi? Mis oleks saanud kui oleksime lisanud tertatsükliini? Selleks, et meie plasmiidis oli ampitsiliini resistentsussait. Kui lisame seda antibiootikumi, jäävad ellu ainult transformeeritud bakterid. Kui oleksime lisanud tertatsükliini pole midagi saanud, sest kõik bakterid oleksid surnud või siis oleks need elus kus on tertatsükliini resistentsus. Aga need ei ole meie bakterid. Mis juhtuks, kui unustaksime lisada X-gali? Kas viga oleks saanud parandada? Milleks X-gali on vaja? 11
70 °C juures. 2. Kompetentseid rakke tuleb võtta jääle sulama ning 10 min pärast lisasin 20 μl rakke ligatsioonisegule. Kogu segu inkubeerisin 30 min jääl. Meie kasutasime DH5α, mille kompetentsus on 107 (see tähendab, et 1 ng-ga transformeeritud tass annab 107 kolooniat) 3. Selle aja jooksul valatakse LB + Amp + X-gal + IPTG tassid: jälle sulatatakse agarsöödet (200 ml) ning pärast 50 °C-ni jahtumist lisatakse 200 μl X-gal, 200 μl ampitsiliini ning 25 μl IPTG-d. Pärast segamist valasin homogeenne sööde õhukese kihina Peetri tassile, kus ta jäi mõneks ajaks tarduma. 52. IPTG-d on lac promootorit aktiveeriv reagent, X-gali on vaja, et bakterite elutegevuse käigus söötmes oli näha sinist pigmenti, antibiootikumi lisatakse, et oleks võimalik selekteerida välja bakterid, kuhu on sisse läinud plasmiid (edukalt transformeeritud elusad bakterid vastava antibiootikumi juuresolekul) 4
annaabi.ee 
