madalam, siis milline on sobiv temperatuur antud PCR reaktsiooniks? T3 51 kraadi, T7 53 kraadi 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. 160-170 nukleotiidi koos mõlemate praimerite ja vektoritega. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Mõlema tulemus 58-5=53 kraadi.denaturatsioon 94 kraadi, ekstensioon 72 kraadi, hübridisatsioon 53 kraadi juures. ¼ minutist ehk lasta 15sek. 13 4
Kui "annealing" või hübridisatsiooni temperatuur peab praimeri sulamistemperatuurist olema ~5 oC madalam, siis sobiv temperatuur antud PCR reaktsiooniks on 56-5=51 oC. 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. T7 promootorist SAC2 ni ja SAC2-st T3 promootorini. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Praimerite X ja Y sulamistemperatuurid on : (9*4+2*11) =58 oC. 4.4) Kui 100 l PCR mastermix kohta panna 8 l 25 mM MgCl2, 10 l 2 mM dNTP ja 5 l mõlemat praimerit kontsentratsiooniga 100 ng/l, siis milline on MgCl2, dNTP ja praimerite lõplik kontsentratsioon?
annaabi.ee 
