kleepuvad. Primaarse antikehaga inkubeerimisel seondub primaarne antikeha antigeeniga antud juhul tubuliiniga. Inkubeerides sekundaarse antikehaga seonduvad sekundaarsed antikehad primaarse antikehaga. Kahekihiline reaktsioon on vajalik selleks, et poleks vaja iga primaarset antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Alusklaasidele panemine on vajalik mikroskopeerimiseks. Sulundamislahus sisaldab DAPI-t, mis seondub DNA-ga ning fluorestseerub siniselt, see võimaldab fluorestsentsmikroskoobiga näha ka DNA-d. 14. a. Kontroll-plasmiidiga rakud: Pildil on näha siniselt DNA, roheliselt edukalt transfekteeritud rakkudes ekspresseeritud GFP ning punaselt antikehaga värvitud tubuliin. pEGFP FoxO3a-ga transfekteeritud rakud: b. Valke detekteerisin kahekihilise reaktsioonina. Primaarseks antikehaks oli Mouse anti
Fluorokroomid on üldiselt tundlikud valguse suhtes, sellepärast on vajalik ka neid liigse valguse eest kaitsta. • Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga • Pesta 1 kord 1 ml MQga Alusklaasidele panemine ehk sulundamine, selleks on vaja: • Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Sulundamislahus “kleebib” rakku Dega katteklaasi alusklaasile ning aitab preparaadil pikemaajaliselt säilida ning ei lase fluorokroomidel aja jooksul tuhmuda. • Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. • Asetada katteklaas (rakud allpool) sulundamislahuse tilga sisse, vältides mulli tekkimist • Lasta kuivada ja säilitada pimedas (valgustundlik!) Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia
annaabi.ee 
