(6) Tsentrifuugi uuesti 5 min. Ja eemalda supernatant täielikult. (7) Veendu, et sade on kuiv, ning lahusta see 20 l formamiidi lahuses (inkubeeri 37oC juures 5 min). (8) Kuumuta 95 oC, 2-3 min (DNA denatureerub, ahelad eralduvad) ja jahuta jääl. (9) Säilita selliselt saadud fluorestsents-märgitud DNA 4oC juures, kuni automaatsekvenaatorisse panemiseni. 15 Lisaülesanded: 5.1) Sekveneerimissegu sisaldab nii dNTP kui ddNTP, mis on nende erinevus? dNTP-desoksü, ddNTP-didesoksü (2' ja 3' asendites vesinikud, terminaatornukleotiid). ddNTP ei inkorporeeru nii hästi, pannakse lahusesse suure kontsentratsiooniga (ülehulgas). 5.2) Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, miks ekstensioon termineerub? 3' otsas on vesinik, ei saa moodustuda fosfodiesterside järgmise nukleotiidiga. 5
isopropanooli, sega õrnalt (käega). (6) Tsentrifuugi uuesti 5 min. Ja eemalda supernatant täielikult. (7) Veendu, et sade on kuiv, ning lahusta see 20 l formamiidi lahuses (inkubeeri 37oC juures 5 min). (8) Kuumuta 95 oC, 2-3 min (DNA denatureerub, ahelad eralduvad) ja jahuta jääl. (9) Säilita selliselt saadud fluorestsents-märgitud DNA 4oC juures, kuni automaatsekvenaatorisse panemiseni. 12 Lisaülesanded: 5.1) Sekveneerimissegu sisaldab nii dNTP kui ddNTP, mis on nende erinevus? dNTP- desoksüribonukleotiid- OH rühm puudub 2´asendis. ddNTP- didesoksüribonukleotiid- OH rühm puudub 2´ja 3´ asendites. Kuna ddNTP-l pole OH rühma 3´asendis ta ei ole võimeline moodustada fosfodiester sideme järgmisega nukleotiidiga. 5.2) Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, miks ekstensioon termineerub? Kui ddNTP inkorporeerib kasvavasse DNA ahelasse, termineerub ekstensioon, sest ddNTP-l pole OH
annaabi.ee 
