Selleks lahjendasime DMEM-is eraldi DNA ja PEI ning seejärel segasime lahused kokku. DEI moodustab DNA-ga kompleksid. Pipeteerisime tranfektsioonisegu plaadile ning lisasime rakususpensiooni. DEI soodustab DNA seostumist rakumembraaniga, fagotsütoosi teel sisenevad DNA:DEI kompleksid rakku. b. Tranfektsiooniprotokoll: 1. Rakkude vaatlemine mikroskoobis, rakkude seisukorra ja tiheduse hindamine. 2. Transfektsioonisegu ettevalmistus. Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI. Võta kolm 1,5 ml epsi. Pipeteeri kõigepealt DMEM, siis lisa esimesse kahte epsi á 0,5 µg plasmiidi (DNA) lahust (kontsentratsioone vaata lisa 2); Kolmandasse epsi sega kokku kõigi transfektsioonide kohta DMEM ja PEI (1µg DNA kohta 2µl PEI-d). DNA:PEI suhe sõltub rakuliinist, vaja optimiseerida. 25 µl DMEM + pEGFP (250 ng/µl), 500 ng = 2 µl. 25 µl DMEM + pEGFP/FoxO3a (1000 ng/µl) 500 ng = 0,5 µl.
] PEI is extremely cytotoxic, by two different mechanisms, the disruption of the cell membrane leading to necrotic cell death (immediate) and disruption of the mitochondrial membrane after internalisation leading to apoptosis (delayed). Esialgu tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra ja tiheduse. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 90%. Transfektsioonisegu ettevalmistamine: Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI. • Esimeses epsis segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFP-C1d (250 ng/μl) kontrollplasmiid – sisaldab pEGFP, ehk kui transfekteerimine õnnestub, rakud peavad flouriseerima flouristent mikroskoobi all. • Teises epsis segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a (conc 1000 ng/μl) uuritav konstrukt. Ehk plasmiidid, mis korrefivad EGFP ja, mis
annaabi.ee 
