Fill-in meetod over-lapping oligonucleotides: Kaks 60-80 mer oligonukleotiide võib sünteesida overlapping otstega. 19. Kirjelda detailselt, kuidas on võimalik, kasutades kahte kattuvat oligonukleotiidi ja fill-in meetodit, konstrueerida sünteetiline geen ning see kloonida, sekveneerida ja ekspresseerida E.colis. Kuidas erinevaid etappe analüüsitakse? Oligonukleotiide sünteesitakse keemiliselt nii, et nenda otsad kattuksid omavahel. Nii need oligonukleotiidsed ahelad seovad omavahel ning kasutades DNA polümeraasi I ja Klenow fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi
Juhtivahel kopeerub katkematult, mahajääv ahel segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel ühendatakse. 2. DNA polümeraase tähistatakse I-V vastavalt avastamise järjekorrale. Polümeraas III on peamine DNA replikatsiooni ensüüm, I, II ja V osalevad pmslt vigade parandamisel. Replikatsioon bakterites: helikaasid keerutavad biheeliksi lahti; lahtikeerdumist kompenseerivad topoisomeraas; DNA polümeraas III kasutab RNA-praimereid; DNA primaas sünteesib oligonukleotiidsed RNA-praimerid. DNA polümeraas I lõikab praimerid välja. DNA ligaas täidab lüngad Okazaki fragmentide vahel. Replikatsiooni erinevused eukarüootides: eukarüootidel on mitu replikatsiooni saiti e replikaatorit. 3. Pöördtranskriptaas e RNA-juhitav DNA polümeraas retroviirustes, mis sünteesib RNA ahelale temaga komplementaarse DNA (cDNA) ahela. Pöördtranskriptaas on väga vigade aldis ensüüm, mille tõttu on viiruse genoom pidevas muutumises. Praimeriks
PCR põhimõtteline skeem. (A) Esimeses tsüklis kasutatakse uuritavas materjalis olevat 2- ahelalist DNA-d sihtmärgina. (B) Toimub 2- ahelalise DNA denaturatsioon, mille tulemusena tekib kaks 1-ahelalist DNA-d. Nende külge seonduvad sünteetilised oligonukleotiidsed parimerid (mustad blokid) 5’>3’suunas. Seejuures on praimerite 3’ otsad suunatud üksteise poole. (C) Termostabiiline DNA polümeraas alustab komplementaarse ahela sünteesi praimeri 3’ otsast. DNA pikenemine tekitab uue lookuse, kuhu saab
annaabi.ee 
