agaroosgeelist. Kaalume enda väljalõigatud osa ja lisame sellele ADB puhvrit. Inkubeerime 55 kraadi juures kuni kogu geel on sulanud ja lahus on homogeenne. Seejärel pipeteerime kõik segu ränikolonni, DNA jääb räni külge. Tsentrifuugime. Valame kogumistopsist puhvri ära ja peseme 2 korda pesupuhvriga. Seejärel lisame elueerimispuhvrit ja tsentrufuugime uuesti. Nüüd saime tulemusekt inserdi ja aktseptorplasmiidi. 3. Järgneb ligatsioon. Võtame vektorit ja inserti suhtes 1:3 ja lisame segule T4 DNA ligaasi ja ligeerimispuhvrit ja MQ’d. Ligeerime 4 kraadi juures üleöö. Kõrvale teeme ka kontroll-proovi mis sisaldab ainult vektor+ligaasi + puhver, ilma inserdita. 4. Järgmiseks sisestame plasmiidi bakterisse selle paljundamise eesmärgil. Selleks lisan reaktsioonisegule E.coli kompetentseid rakke, inkubeerin 15- 30 minutit jääl ja samalajal valan petri tassi LB söötme, kanamütsiili
adenosiini (A) küljes. A nukleiinhappejääki nimetatakse hargnemispunktiks (branchpoint), sest ta moodustab 14 lariaadistruktuuris RNA haru. Kummagi transesterifikatsiooni käigus vahetatakse üks fosfodiesterside teisega välja. Kuna fosfodiestersidemete arv molekulis ei muutu, siis energiat selles reaktsioonis ei kulu. Kahe reaktsiooni summaarseks tulemiks on kahe eksoni ligatsioon ning nende vahelise-introni vabastamine lariaat- struktuurina. 46. Kirjelda protsesse, mille tulemusena tekib ühest pre-mRNAst hulgaliselt erinevaid mRNAsid. Alternatiivne splaissing - mRNA protsessingu peamiseks regulatsiooni mehanismiks, selleks on vaja vähemalt kaht intronit (kolme eksonit). Selle käigus võib eksoneid pikendada või vahele jätta, saades nii palju erinevaid mRNA-sid. 47. Too näiteid, kuidas alternatiivne splaising muudab bioloogilist funktsiooni
annaabi.ee 
