Ehk PCR võtame 3*1,25*3,7 µl 10x puhver: 10/10 = 1 Ligaas: 5U/ µl tahame saada 2,5U ehk võtame 0,5 µl 9 MQ: 10-1,25-3,75-1-0,5 = 3,5 Töö käik: Pipeteerin kokku ligeerimissegu Jälgin et lahus saaks homogeenseks Tsentrifuugin Jätan üleöö ligeerima +4 kraadi juurde. Millise konstrukti oma töö käigus kloneerisin? Ligeerisin sellise konstrukti, kus bSTBlue-1 vektoris EcoRV saidis on minu insert ehk DST geen. Milleks kasutasime kloneerimisel pSTBlue-1 vektorit? Mis teeb selle eriliseks? See on meie vahevektor ja see on väga hea kuna võimaldab sini-valge skriinimist ja seal on mõlemal pool EcoRV saiti EcoRI sait, ehk seda oli väga lihtne restriktaasidega lõigata. Kas sini-valge selektsiooni kasutamisel võib õige koloonia olla ka sinine? Miks? Vahel ikka juhtub
CCCCATACGAGGCCTACAAGAGGGGCATCATCGACAGGGGCCAGTACTTGC AGCTGCAGGAGCTCGAGTGTGACTGGGAGGAGGTCACCACCTCGGGGCCCT GTGGGGAGGAGTCTGTGCTCCTGGACCGCAAGAGCGGGAAGCAGTACTCCA TCGAGGCCGCCCTCCGCTGCCGGCGCATCTCTAAGGAGGAGTACCATCTGT ACAAGGACGGCCACCTGCCCATCTCCGAGTTTGCGCTGCTTGTAGCTGG GG AGACCAAGCCAAGCTCCGGATCCA Tumedaga allajoonitud osa on vektoris tagurpidi. Sinisega märgitud A kohal on toimunud mutatsioon, selle asemel on C. Selle tulemusel muutub ka valgu järjestus. b) Sekveneerimise tulemuse järgi kloneerisin inimese envoplakin geeni (Homo sapiens envoplakin (EVPL)) c) i. Saadud sekventsi pikkus oli 1049 bp. Sekventsi algus ning lõpp olid kehvema kvaliteediga, keskmise osa kvaliteet oli küllaltki hea, piigid joonistusid selgelt välja ning olid loetavad. ii. Sekveneeritud sai terve sisestatud insert. iii. Järjestuses on tekkinud üks punktmutatsioon, kus A on muutunud C-ks. See muudab ka aminohapet E asemel sünteesitakse A. 8
annaabi.ee 
