4. DNA – geeli – puhveri segu pipeteerisin Zymo-SpinTM kolonni (mis oma korda koosneb kolonnist ja kogumistopsist. Kolonn sisaldab ränifiltri, läbi mille me laseme oma segu jooksma. DNA seostub räniiksiidi osakestega, sellega ta ei saata kogumistopsi, vaid jääb kolonni filtri peale. Kolonni saagis minu DNA lõigule on vahemikus 70-90%) ja tsenrifugeerisime 30sek ja viskasin läbivoolatud puhver välja. 5. Lisasin 200µl pesupuhvrit ja jalle fuugisin 30 sek x2 korda, et olla kindel, DNA on puhas. 6. DNA elueerimiseks kasutasime MQ vett, mille pH oli > 6.0 (teisel juhul, DNA võib kahjustuda). Panin 10µl MQ vett peale ja fuugisin 1 min jooksul. DNA vabanes ränioksiidist ja sai kogumistopsiku sisse. 7. Kontrollin, kas eluaat sisaldab minu DNA lõiku, või puhastamise jooksul tekkisid vead: segasin kokku 1,8 µl DNA värvi, µl MQ H2O ja µl eluaati, ning panin jooksma kontrollgeelile (kokku on 10,8 µl).
reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada. See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2. Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse. 3. PCRi programmi kirjutamine: 1. 95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine 2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2. punktist 21 korda 22. Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist. HotFIRE Pol sünteesib keskmiselt 1 kb
annaabi.ee 
