148. 5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ + 50 μl Tween 20 Permeabiliseerimislahus: 50 mM NH4Cl, 0,5% Triton X-100 PBSis, 1 ml 149. 50 μl 1M NH4Cl + 50 μl 10% Triton X-100 + 100 μl 10x PBSi + 800 μl MQ Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml (oli valmis) 150. 0,04 g BSA-d + 20 μl 10% NaN3 + 1,98 ml MQ 151. 152. 2. Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 3. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust (lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks), inkubeerida 15 min ning pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 4. Blokeerimine: lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust, jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise
lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks. o 100 μl 10x PBSi o 800 μl MQ 5) Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml. o 0,04 g BSA-d o 20 μl 10% NaN3 NaN3 kasutatakse konservandina (takistab bakterite elutegevust). Väga toksiline aine. o 1,98 ml MQ Fikseerimine: • rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde • lisada 0,5 ml fikseerimislahust. PFA tekitab kovalentsete sidemete võrgustiku säilitades valkude ja DNA asukoha rakus ning seeläbi jääb püsima ka raku kuju. Rakud ei lagune, seega saab vaadata kus kohas paiknes uuritav valk fikseerimise ajal. • inkubeerida 15 min • pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Ülearune vaba PFA tuleb välja pesta, et hiljem ei reageeriks BSA ega antikehadega. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine:
annaabi.ee 
