mutatsioone. 15 Mis juhtub kui proovid ühes reaktsioonisegus kahe praimeriga korraga sekveneerida? Saame kaks nukleotiidset järjestus mis katavad üksteist ja teevad lugemise võimatuks. Väga pikkade fragmentide sekveneerimiseks kasutatakse forward ja reverse praimereid, kuid eraldi reaktsioonides. Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik: Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami! Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna
kloneerimisvektorisse sisestatud järjestus edasi mõnda ekspressiooni vektorisse. Selline vektor sisaldab vajalikke järjestusi valgu ekspressiooniks rakkudes, aga ka bakteris paljundamist võimaldavaid elemente, kuid millesse kloneerimine otse PCR-ist oleks liiga tülikas. Seega restrikteeritakse esialgsest bakteriaalsest vektorist soovitud järjestus uuesti välja ja ligeeritakse samade restriktaasidega lõigatud ekspressioonivektori MCS-i. Uut konstrukti paljundatakse jällegi algul bakterites ja puhastatakse välja suurem kogus DNA-d. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82.
annaabi.ee 
