2. Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 3. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust (lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks), inkubeerida 15 min ning pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 4. Blokeerimine: lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust, jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. 153. 154. 155. 156. Teine päev – immuunotsütokeemia 1. Inkubatsioon primaarse antikehaga. Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (200 μl): 20 μl 2% BSA lahust + 180 μl 1x PBSi + Mouse anti tubuliin 1:500 0,4 μl, segada. Lisada lahus
• inkubeerida 15 min • pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Ülearune vaba PFA tuleb välja pesta, et hiljem ei reageeriks BSA ega antikehadega. Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust • inkubeerida 15 min • pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Blokeerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust • jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. Teine päev – immuunotsütokeemia Immuunotsütokeemias kasutatakse valkude detekteerimiseks rakus antikehasid. Rakubioloogias kasutatakse kahte tüüpi antikehasid: monoklonaalsed ja polüklonaalsed.
annaabi.ee 
