4. 72 o C 3 minutit komplementaarse DNA ahela süntees (primeri ekstensioon) 5. Korda alates 2. punktist veel 21 korda Esimese etapi pikkus sõltub valitud ensüümist, me kasutasime Hot FIREPol DNA polümeraasi, mis aktiveerub pärast 15 minutit inkubeerimist 95 o C juures. Teine etapp on vajalik selleks, et kas lisatud template DNA või eelmises tsüklis sünteesitud DNA ahelad denatureeruks, see peab olema võimalikult lühike. Kolmanda etapi (annealingu) pikkus sõltub kasutatud praimerite järjestusest mida suurem on G-de ja C-de arv, seda rohkem on vaja aega annealinguks. Kuna me kasutasime erinevaid praimereid, kuid sama programmi, ei pruugi annealingu aeg olla täiesti optimaalne, kuid siiski piisavalt täpne. Sünteesi pikkus sõltub nii kasutatavast ensüümist kui ka paljundatava järjestuse pikkusest, kuna me kasutasime kõik sama programmi, siis on valitud pigem pikem aeg (valitud on 3 minutit,
Võib saavutada nii ,,blunt" kui ka ,,sticky" otsad. Sünteetilised geenid väikestest sünteesitud oligonukleotiididest: Oligonukleotiide keemiliselt sünteesitakse (20-60mers) nii, et nende järjestused pärast annealingu moodustuksid kaksikahelat. In vitro süntees: sünteesitud oligonukleotiidid on projekteeritud nii, et moodustada baaspaare, mille vahel on tühikud. Suurte geenide süntees: rohkem kui 1000bp. Kogu geeni võib moodustada mitmetest oligonukleotiididest, millest 4-6 on omavahel kattuvad (overlapping). Fill-in meetod over-lapping oligonucleotides: Kaks 60-80 mer oligonukleotiide võib sünteesida overlapping otstega. 19
annaabi.ee 
