"transformatsioonisegule" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

 Võtame -80kraadi juurest E.coli rakud sulama.  Transformeerimiseks võtame 100 µl kompetentseid rakke ja lisame reaktsioonisegule.  Inkubeerime 15 minutit jääl.  Sulatame 200ml LB söödet, jahutame umbes 50 kraadi juurde (muidu ampitsilliin laguneb kuumuse käes ära) ja lisame sinna X-gal, IPTG ja ampitsilliini. Loksutame segamini ja valame söötme õhukeste kihtidena Petri tassidele.  Teeme transformatsioonisegule kuumašokki 50sekundit 42 kraadi juures. Meetod seisneb selles, et CaCl2 tõttu DNA tõmbus rakumembraanide ligi. Ja nüüd kui paneme oma segu sooja, siis membraanikahjustuse tagajärjel DNA migreerub raku sisse.  Tõstame tuubi 5minutiks jääle jahutma  Järgneb elustamisefaas. Selleks lisame 500 µl vedelat LB söödet ja inkubeerime 30 minutit 37 kraadi juures.  Tsentrifuugime bakterid põhja  Eemaldame sööte bakterite pealt