"transfektsioonireagendi" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia

Kolmandasse epsi sega kokku kõigi transfektsioonide kohta DMEM ja PEI (1µg DNA kohta 2µl PEI-d). DNA:PEI suhe sõltub rakuliinist, vaja optimiseerida. 25 µl DMEM + pEGFP (250 ng/µl), 500 ng = 2 µl. 25 µl DMEM + pEGFP/FoxO3a (1000 ng/µl) 500 ng = 0,5 µl. 2x = 25 µl DMEM + 2x1 = 2 µl PEI lahust 3. Jagada DMEM+PEI segu võrdselt DNA segudele (26 µl kaupa), segada läbi, tsentrifuugida ja inkubeerida 10-15 minutit toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja transfektsioonireagendi PEI kompleksid, lahus muutub häguseks. 4. Tõsta katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. 5. Pipeteerida transfektsioonisegud klaasidele. Aja kokkuhoiu mõttes jätsime meie ära tsentrifuugimise ning pipeteerisime transfektsioonisegu kohe klaasile ning alles seejärel inkubeerisime 15 minutit. Rakkude külvamine 24-augulisele plaadile 6. Rakkude vaatlemine mikroskoobis. Rakkude tihedus umbes 100% 7