"transfektsioonide" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia

rakumembraaniga, fagotsütoosi teel sisenevad DNA:DEI kompleksid rakku. b. Tranfektsiooniprotokoll: 1. Rakkude vaatlemine mikroskoobis, rakkude seisukorra ja tiheduse hindamine. 2. Transfektsioonisegu ettevalmistus. Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI. Võta kolm 1,5 ml epsi. Pipeteeri kõigepealt DMEM, siis lisa esimesse kahte epsi á 0,5 µg plasmiidi (DNA) lahust (kontsentratsioone vaata lisa 2); Kolmandasse epsi sega kokku kõigi transfektsioonide kohta DMEM ja PEI (1µg DNA kohta 2µl PEI-d). DNA:PEI suhe sõltub rakuliinist, vaja optimiseerida. 25 µl DMEM + pEGFP (250 ng/µl), 500 ng = 2 µl. 25 µl DMEM + pEGFP/FoxO3a (1000 ng/µl) 500 ng = 0,5 µl. 2x = 25 µl DMEM + 2x1 = 2 µl PEI lahust 3. Jagada DMEM+PEI segu võrdselt DNA segudele (26 µl kaupa), segada läbi, tsentrifuugida ja inkubeerida 10-15 minutit toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja transfektsioonireagendi PEI kompleksid, lahus muutub häguseks. 4