"restriktsioonisaidid" - 1 õppematerjal

Molekulaarbioloogia aruanne

vaja paljundama  0,1 μl 5 U/μl HotFIRE Pol Polümeraasi (lõppkonts. 0,5 U/μl) – katalüüsib PCRi, peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof- reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada. See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna  meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2. Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse. 3. PCRi programmi kirjutamine: 1. 95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine 2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5