Ensümoloogia protokoll
Aluselised fosfataasid on looduses laialt levinud, kuid
tavaliselt isoleeritakse seda ensüümi E.colist või veise soolestikust. Antud töös uuritakse veise
soolestiku fosfataasi ensüümikineetikat.
ALUSELISE FOSFATAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Aluselise fosfataasi aktiivsuse määramiseks kasutatakse kromogeenset substraati p-
nitrofenüülfosfaati (pNPP), mille hüdrolüüsi on võimalik kvantitatiivselt jälgida.
Ensüümreaktsiooni käigus hüdrolüüsitakse pNPP p-nitrofenooliks ja anorgaaniliseks
fosfaadiks. Protoneeritud vormis p-nitrofenool ei neela nähtavat valgust, kuid aluselises
keskkonnas deprotoneeritud vormis (p-nitrofenolaat) neelab intensiivselt valgust
lainepikkustel 400-415 nm (ekstinktsioonikoefitsient 410 = 18400 M-1cm-1). Kuivõrd pNPP
neelab ainult spektri ultraviolettpiirkonnas (vt joonis 2), saab spektrofotomeetri abil jälgida p-
nitrofenolaadi tekkimist ning määrata reaktsiooni toimumise kiiruse.
annaabi.ee 
