"ligeerimisprotokoll" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia

viimane dimeriseerub ja oksüdeerub ­ tekib indigosinist värvi dikloro-dibromo-indigo, mis värvib indigosiniseks terve koloonia. Kui lacZ operoni sisestada insert, siis see rikub (suure tõenäosusega) lacZ operoni lugemisraami, -galaktosidaasi ei ekspresseerita, eelkirjeldatud protsessi ei toimu ning kolooniad jäävad valged. See võimaldab vaatluse teel eristada kolooniaid, kus insert on plasmiidi sisenenud, ja kolooniaid, kus on vaid tühi plasmiid. e) Ligeerimisprotokoll: 1. Pipeteerida ligeerimissegu (kokku 5 l): 1 l puhastatud PCR produkti 1 l plasmiidi (9ng/ l) 0,5 l 10x ligeerimispuhvrit 0,5 l e. 5 ühikut T4 DNA ligaasi (5 U/l)(hoida jääl või külmakehas) 2 l Milli-Q vett 2. Homogeniseerida lahus pipeteerimise või vortexi teel (kasutasin pipeteerimist). 3. Vajadusel tsentriguugida segu põhja (kuna kogu ligeerimissegu pipeteerisin