tootmist 3. uurida geeni struktuuri, funktsiooni DNA fragmentide saamine ja ühendamine DNA restrikteerimisel tekivad kas 5' või 3' üleulatuvate üheahelaliste sabade, või nn. tömpide otstega DNA fragmendid. Oluline on konverteerida DNA otsad ühendatavateks. Omavahel ühendatavad on kaheahelalise DNA tömbid ja 5' või 3' üheahelalised komplementaarsed DNA otsad. Mittekomplementaarsed üheahelalised osad tömbistatakse ehk täidetakse (Vt. DNA märkimise loengust - Klenowi fragmendi ja T4 polümeraasiga). Kõigi kolme erinevat tüüpi otstega DNA molekulide ühendamiseks kasutatakse ligeerimist s.o. DNA fragmentide ühendamist ligaasi abil. Ligaas katalüüsib kovalentse sideme moodustumist 5'-fosfaat- ja 3'- hüdroksüülrühma vahel. Enamasti kasutatakse T4 DNA ligaasi. Optimaalsete tingimuste korral on inserdi kloonimisse efektiivsus keskmiselt 1:50 st. ühel juhul siseneb insert vektorisse ja 49-l juhul toimub lihtne vektori retsirkulariseerumine.
a) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) b) DNA kloonimist plasmiidi ja paliundamist bakterite abil c) DNA keemiline süntees d) Western blot 20. Milline järgnevatest ensüümidest hoiab ära restriktaasiga avatud vektorplasmiidi retsirkulatsiooni kloonimise käigus: a) Veise soole fosfataas (calf intestine phosphatase-CIP) b) T4 DNA ligaas c) DNA polümeraas I Klenowi fragment d) Taq DNA polümeraas e) AMV pöördtranskriptaas Kontrolltöö 2. 1. Milliseid eelteadmisi on vaja meid huvitava ensüümi omaduste muutmiseks ratsionaalse (re)disani meetodil? a) Ensüümi aktiivtsentri ja toimemehhanismi tundmine b) Selektsioonisüsteemi olemasolu mutantide valikuks c) Võimalus rekombineerida erinevatest homoloogsetest organismidest pärit ensuume d) Valgu 3D struktuuri tundmine 2
Radioaktiivne märge oli nii supernatandis kui ka DNA sademes. Kuna nukleotiidid antud tingimustes sadeneda ei saanud, näitasid katsetulemused radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse, seega DNA sünteesi toimumist. Lisaks 5' 3' polümeraassele aktiivsusele on Pol I-el ka 5' 3' ja 3´ 5' eksonukleaasne aktiivsus. DNA polümeraas I deletsioonvarianti, millel puudub 5' 3' eksonukleaasne aktiivsus, nimetatakse Klenowi fragmendiks. E. coli DNA polümeraas III DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm Ta koosneb mitmetest subühikutest. Multiensüümkompleks on V-kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud , ja . Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel
Radioaktiivne märge oli nii supernatandis kui ka DNA sademes. Kuna nukleotiidid antud tingimustes sadeneda ei saanud, näitasid katsetulemused radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse, seega DNA sünteesi toimumist. Lisaks 5' 3' polümeraassele aktiivsusele on Pol I-el ka 5' 3' ja 3´ 5' eksonukleaasne aktiivsus. DNA polümeraas I deletsioonvarianti, millel puudub 5' 3' eksonukleaasne aktiivsus, nimetatakse Klenowi fragmendiks. E. coli DNA polümeraas III DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm Ta koosneb mitmetest subühikutest. Multiensüümkompleks on V-kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud , ja . Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel
annaabi.ee 
