"inserdita" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

räni külge. Tsentrifuugime. Valame kogumistopsist puhvri ära ja peseme 2 korda pesupuhvriga. Seejärel lisame elueerimispuhvrit ja tsentrufuugime uuesti. Nüüd saime tulemusekt inserdi ja aktseptorplasmiidi. 3. Järgneb ligatsioon. Võtame vektorit ja inserti suhtes 1:3 ja lisame segule T4 DNA ligaasi ja ligeerimispuhvrit ja MQ’d. Ligeerime 4 kraadi juures üleöö. Kõrvale teeme ka kontroll-proovi mis sisaldab ainult vektor+ligaasi + puhver, ilma inserdita. 4. Järgmiseks sisestame plasmiidi bakterisse selle paljundamise eesmärgil. Selleks lisan reaktsioonisegule E.coli kompetentseid rakke, inkubeerin 15- 30 minutit jääl ja samalajal valan petri tassi LB söötme, kanamütsiili. 30 minuti järel teen kuumašoki 42 kraadi juures 50 sekundit. Lisan LB söödet ja inkubeerin 37 kraadi juures. Kannan bakterid petri tassile ja jätan nad kasvama. 5. Valin koloonia ja kontrollin kas ligatsioon töötas