"inserdis" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik:  Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami!  Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada. Ümberkloneerimist ei saa teha vaid ühte restriktaasi kasutades, kuna pärast me ei saaks kontrollida kumba pidi insert vektorisse siseneb. Meil on vaja aga, et ta õiget pidid siseneks, muidu me ei saa funktsionaalset valku. Doonorplasmiid pSTBlue1 vektor koos meie inserdiga