"hotfirepol" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

Antud järjestuse sulamistemperatuuriks on 59,3 kraadi, mille leidsin: http://eu.idtdna.com/site/Order/oligoentry/set? seq=GCCATCTCATGCCCATCGC. Kasutaksin hübridiseerimistemperatuuriks 59 kraadi. Mille järgi valitakse ekstensiooniaeg? Kui pikk see oleks 2000bp produkti korral, kasutades samu reagente nagu praktikumis? 4 Ekstensiooniaeg sõltub amplifitseeriva järjestuse pikkusest ja G/C-nukleotiidide osakaalust. Kuna meie poolt kasutatud HotFIREPol sünteesib keskmiselt 1kb DNAd ühe minuti jooksul, siis läheks teoreetiliselt sellel aega 2 minutit, aga anname natukene lisaaega ka ja ütleme et 2,5 minutit. Kui esialgses reaktsioonis on 4 molekuli matriits DNA’d, siis mitu molekuli PCRi produkti on tekkinud pärast 25.tsükli lõppemist. Tehniliselt võiks mõelda et kui on 4 molekuli, siis see on 2 2. Ja tehtud on 2 ringi PCRi. Liidame selle 25le juurde ja saame tehniliselt 27 ringi, kui oleksime alustanud 1 molekuliga. 227=134217728