"dnaaasid" - 1 õppematerjal

Molekulaar- ja rakubioloogia

6.1 Praktikum – minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine.  Võtsin üleöö kasvanud bakterid ja fuugisin bakterid põhja  Eemaldasin supernatanti  Re-suspendeerisin pellet 0,2 ml-s E1 lahuses (50mM glükoos – teeb lahuse isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA-Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml – eemaldab bakteriaale RNA prepsist).  Lisasin 0,2 ml E2 lahus(0,2 N NaOH, 1% SDS – detergent, lõhustab bakteriraku membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima. Kuna plasmiidne DNA on tsirkulaarne, siis ahelad ei eralduvad), suspendeerisin.  Inkubeerin laua peal 5 minutit.