DNA puhtus Kõrge kvaliteedi, puhtusega DNA, mis on sobilik sekveneerimiseks, ligatsioonireaktsiooniks jne... Kui palju DNA saadakse 50bp-10kb puhul 70-90% Praktiline töö nr. 5: Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Eesmärk: Meid huvitava aplifitseeritud DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk paljundusplasmiidi. Materjalid: 1,25 µl pSTBlue-1 vektor Lineaarne vahevektor, kus on origin, (16ng/µl) antibiootikumide resistentsusgeen, lacZ üksus ja AccepTor kloneerimissait. 3,75 µl PCR produkt Sisaldab inserti 1 µl 10X ligeerimispuhvrit Loob sobiva keskkonna 0,5 µl T4 DNA ligaasi (5U/µl) Ligeerib inserdi ja vektori kokku
Vett saab kasuta ainult juhul, kui selle pH > 6,0. 6. Jälle fuugimine 1 minuti jooksul – praimerite, nukleotiidide ja erinevate soolade eraldamine. Epsis on elueerinud PCRi produkt, mis on valmis edasiseks ligeerimiseks. 37. 38. 39. 40. Kontrollgeeli pilt. Oodatav produkti pikkus – 700 aluspaari, pildil on näha, et umbes nii see ongi. 41. 42.Rekombinantse plasmiidi ligeerimine 43. Eesmärgiks on meie DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk tervikliku plasmiidi taasloomine. Väga tähtis segada vektor ja sisestav DNA omavahel sobivates kontsentratsioonides, iga molekuli vektori jaoks peaks olema segus kolm sisestava DNA molekuli. DNAde otsad seovad komplementaarselt kokku ligaasi abil. 44. Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste
annaabi.ee 
