a. 40 µl 2% BSA lahust b. 360 µl 1x PBSi c. Goat anti mouse Alexa546 1:2000 0,2 µl, segada. 2. Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. 3. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. 4. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. 5. Pesta 1 kord 1 ml milliQ (destilleeritud) veega. VI Alusklaasidele panemine ehk sulundamine 1. Kirjuta alusklaasile oma nimi ja kuupäev, samuti kasutatud antikeha. 2. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. 3. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivata serv vastu pehmet paberit. 4. Aseta katteklaas (rakud allpool !!!) sulundamislahuse tilga sisse (väldi mulle). 5. Lasta kuivada ja säilitada pimedas. b. Lahjenduste tegemise arvutused: 1) Primaarse antikeha lahjendus: Vaja on 400 µl lahust, kuna meil on 2 klaasi, kummagi kohta 200 µl. 2% BSA tuleb lahjendada 0,2%, seega tuleb lahjendada 10x, 10% lahusest peab olema BSA, seega tuleb võtta 400/10=40 µl
BSA lahust + 360 μl 1x PBS-Tweeni + Goat anti mouse Alexa568 (punast värvi) 0,2 μl, segada. Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. Pesta 1 kord 1 ml MQga. 3. Alusklaasidele panemine ehk sulundamine. Kirjutada alusklaasile oma nimi, kuupäev ja kasutatud antikeha. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. Asetada katteklaas (rakud allpool!) sulundamislahuse tilga sisse (vältida mulle) Lasta kuivada ja säilitada pimedas 157. 158. Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia 159. Fluorestsentsmikroskoobi tööpõhimõte: ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini
Praktikas kasutatakse korraga tavaliselt 2-3 antikeha, on võimalik ka rohkem. Fluorokroomid on üldiselt tundlikud valguse suhtes, sellepärast on vajalik ka neid liigse valguse eest kaitsta. • Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga • Pesta 1 kord 1 ml MQga Alusklaasidele panemine ehk sulundamine, selleks on vaja: • Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Sulundamislahus “kleebib” rakku Dega katteklaasi alusklaasile ning aitab preparaadil pikemaajaliselt säilida ning ei lase fluorokroomidel aja jooksul tuhmuda. • Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. • Asetada katteklaas (rakud allpool) sulundamislahuse tilga sisse, vältides mulli tekkimist
annaabi.ee 
