Proteolüütilise ensüümi aktiivsus avaldatakse hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Kasutatakse sõltuvalt uuritava proteaasi omapärast vastavaid substraate ja talle sobiva Ph-ga puhvreid. Selles töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini. Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestatakse TKÄ-ga, mis ühtlasi peatab ka ensüümi. Seejärel määratakse mitte sadestuvad hüdrolüüsi produktid spektrofotomeetriga. Töö käik 1. Valmistasin uuritava proteaasi Savinase lahuse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Kaalusin analüütilistel kaaludel ensüümi 0,006 g. Viisin selle kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Lisasin väikse koguse puhvelahust ja loksutasin, kuni ensüüm lahustus. Seejärel lisasin puhverlahust juurde, nii, et seda oli kokku 5ml. 2. Võtsin 50ml mahuga suurema katseklaasi ja pipteerisin sinna 25ml 2%-list
6 1ml 0,062 mg /ml glükoosilahus+ standardlahuse 0,1176 D 3ml tööreaktiiv lahjendus Kõiki proove loksutatakse kohe peale tööreaktiivi lisamist ning fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg. Reaktsiooni toimumiseks jäetakse katseklaasid 20 minutiks seisma. Reaktsiooni lõppedes peaksid glükoosi sisaldavad lahused muutuma tekkinud K-heksatsüaanoferraat (III) toimel kollaseks. Seejärel mõõdetakse spektrofotomeetriga kõikide lahuste optilised tihedused 410 nm juures. Saadud glükoosilahuste optilise tiheduse ja teadaolevate kontsentratsioonide põhjal koostatakse kalibreerimisgraafik, mille põhjal määratakse uuritava proovi sidrunimahla- glükoosisisaldus. Loen kalibreerimisgraafikult uuritava lahuse optilise tiheduse väärtuste põhjal, et glükoosisisaldus uuritavas lahuses oli vastavalt: 1) 0,07 mg/ml 2) 0,065 mg/ml
Proteaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse erinevaid pH piirkondi: hapud proteaasid, neutraalsed ja leelisproteaasid. Selles töö toimus uuritava proteaasi aktiivsuse määramine pH=8,4 juures. Antud töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini. Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja peptiidid sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisaldus määratakse spektrofotomeetriga. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks on 1 kat. See on ensüümi hulk, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 sekundi vältel 30 °C juures. Töö käik Kõigepealt valmistasin 5 ml uuritavat proteaasi lahust. Selleks kaalusin 0,0049 grammi tahket
1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Sidrunimahl Mul oli sidrunimahl lahjendatud 1:50 1 ml mahla + 49 ml dest.vett Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Kaliibrimisgraafiku koostamiseks tuleb võtta kolm teatud glükoosikontsenratsiooniga proovi ja võrrelda kontsentratsioone spektrofotomeetriga antud tulemustega (lainepikkus 410 nm) ning koostada graafikut. Proovide mistamine aldab standard+lahusest, mis sisaldab täpselt 1 mg/ml glükoosi. Sellest lahusest valmistatakse kolm lahjemat proovi, reeglina nande kontsentratsioonid on 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Skeem on toodud allpool. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks
konts-ga lahust ning 5 ml vett saadi 0,062 mg/ml konts-ga lahus. Võeti 6 puhast katseklaasi, nummerdati. Katseklaasi nr 1 pipeteeriti 1 ml destilleeritud vett (0-proov), katseklaasidesse nr 2 ja 3 1 ml uuritavat lahust, katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust. Igasse katseklaasi lisati 3 ml tööreaktiivi, loksutati. Katseklaase hoiti 20 minutit toatemperatuuril. Selle aja möödudes mõõdeti spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optiliste tiheduste väärtused. Tulemused Katseklaasi nr D Korrigeeritud D 1 0,0417 0 2 0,2024* 0,1607* 3 0,2012* 0,1595* 4 0,2368 0,1951 5 0,1628 0,1211 6 0,1033 0,0616
Peenestamise kiirendamiseks lisatakse puhast kvartsliiva ning niiskuse eemaldamiseks proovist lisatakse veevaba Na 2SO4 senikaua, kuni proovist on kogu vesi välja saadud. Järgnevalt lahustatakse karotenoidid segust välja sobiva orgaanilise lahustiga (petrooleeter). Kogusin segust karotenoidi de lahust ja filtrisin selle kuiva 25 ml mõõtsilindrisse. Ekstraheerimine kestis seni, kuni petrooleetri lahus muutus värvituks. Ekstraheerimine toimub tõmbekapi all. Spektrofotomeetriga analüüsitakse saadud lahust, et teha kindlaks, missuguseid karotenoide lahus sisaldab. Saadud andmete põhjal arvutatakse välja ka karotenoidide kvantitatiivsed kogused lahuses. Katseandmed Lahuse spekteranalüüsil on näha kolme tippu e. maksimumkohta. Lahuse lahuse neoksantiini E1cm1% lainepikkus , nm neelduvus lainepikkus, nm 464 0,4886 467 3110
2,3 pipeteerin 1ml uuritavat lahust(2 paralleelproovi) Katseklaasidesse nr.4,5,6 pipeteerin igaühte 1ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust. Igasse katseklaasi pipeteerin 3ml tööreaktiivi ja loksutan kohe,et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Fikseerin reaktsiooni alguse aeg ja katseklaase hoian 20 minutit toatemperatuuril.Reaktsiooni tulemusena glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva K-heksatsüanoferraat(lll) toimel kollaseks. 20 minuti pärast mõõdan spektrofotomeetriga lainepikkusel 410nm lahuste optilise tiheduse väärtused. Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Katse tulemused: 1) 0-proob 0,059ABS 2) Uuritav lahus 0,173ABS 3) Uuritav lahus 0,170ABS 4) Glükoosi lahus 0,25mg/ml 0,196ABS 5) Glükoosi lahus 0,125mg/ml 0,130ABS 6) Glükoosi lahus 0,62mg/ml 0,106ABS Kaliibrimisgraafik: Leiame saadud sirge võrrandi valemiga:
4) Värvusreaktsiooni läbiviimine. - 6 Katseklaasi asetatakse statiivi. - Igale lisatakse erinevaid proovi: · 0-proov (destileeritud vesi). Kasutatakse võrdluslahusena. · 2 katseklaasi 1ml uuritava lahusega · 3 katseklaasi kaliibrimislahustega - Igasse katseklaasidesse pipeteeritakse 3ml tööreaktiivi ja loksutakse. - Katseklaasi hoitakse 20 minutit toatmperatuuril. - Mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused. 5) Koostame kaliibrimisgraafiku. Töö tulemused. Lahus: Absorbtsiooni väärtus: Glükoosilahus 1 (0,25 0,1318 ABS mg/ml) Glükoosilahus 2 (0.125 0,0947 ABS kalibrimislahused mg/ml) Glükoosilahus 3 (0,062 0,0576 ABS
lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja eemaldasin siis kolbi ja kogusin edasi vedelikku fraktsioonidena nummerdatud ja kaliibritud(2ml) katseklaasidesse. Fraktsioone kogusin seni, kuni eluaadi värvituks muutumiseni ja oli näha, et kogu värviline osa oli ka kolonnist eemaldunud. Seejärel mõõtsin värviliste fraktsioonide optilised tihedused spektrofotomeetriga. Andmete analüüs: Eluaadi maht kolvis oli Vv= 23,5ml. Siis vastavalt iga järgmine fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra. Lainepikku Fraktsiooni Eluaadi Optiline s number maht tihedus (nm) (ml) (ABS) 670 1 25,5 0,094 2 27,5 0,487 3 29,5 0,357 4 31,5 0,06 410 10 41,5 1,386
väljuvat eluaati koguti väiksesse mõõtsilindrisse. Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl
Seejärel peenestatakse proov uhmris nuiaga. Peenestamise kiirendamiseks lisatakse puhast kvartsliiva ning niiskuse eemaldamiseks proovist lisatakse veevaba Na2SO4 senikaua, kuni proovist on kogu vesi välja saadud. Järgnevalt lahustatakse karotenoidid segust välja sobiva orgaanilise lahustiga (oktaan). Kogusin segust karotenoidide lahust ja filtrisin selle kuiva 25 ml mõõtsilindrisse. Ekstraheerimine kestis seni, kuni oktaani lahus muutus värvituks. Ekstraheerimine toimub tõmbekapi all. Spektrofotomeetriga analüüsitakse saadud lahust, et teha kindlaks, missuguseid karotenoide lahus sisaldab. Saadud andmete põhjal arvutatakse välja ka karotenoidide kvantitatiivsed kogused lahuses. Katseandmed Lahuse spekteranalüüsil on näha kolme tippu e. maksimumkohta. Lahuse lahuse LÜKOPEEN E1cm1% lainepikkus , nm neelduvus I lainepikkus, nm 447 0,4518 446
müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 31cm Diameeter: 2cm, raadius=1cm, seega kolonni maht: 3,14x31=97,34 k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x97,34= 9,734 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg: 97,34-9,734= 87,6ml Fraktsioonide üldarv n= 2ml n= Vxmax/2 =87,6/2= 43,8 Kokku tuli 50 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva vedeliku maht: 29 ml, seega teeb kokku 50x2= 100+29=129 ml Vx= 29ml Rf=29-97,34/87,6-97,34=7,016 Proovide optilised tihedused:
Peenestamise kiirendamiseks lisatakse puhast kvartsliiva ning niiskuse eemaldamiseks proovist lisatakse veevaba Na 2SO4 senikaua, kuni proovist on kogu vesi välja saadud. Järgnevalt lahustatakse karotenoidid segust välja sobiva orgaanilise lahustiga (petrooleeter). Kogusin segust karotenoidide lahust ja filtrisin selle kuiva mõõtsilindrisse. Ekstraheerimine kestis seni, kuni petrooleetri lahus muutus värvituks. Ekstraheerimine toimub tõmbekapi all. Spektrofotomeetriga analüüsitakse saadud lahust, et teha kindlaks, missuguseid karotenoide lahus sisaldab. Saadud andmete põhjal arvutatakse välja ka karotenoidide kvantitatiivsed kogused lahuses. Katseandmed Lainepikkus, nm Lahuse neelduvus 425,5 0,2920 451,5 0,4055 477,5 0,3571
Küvett 2: uuritavat proovi 250 l Küvett 3: uuritava proovi paralleel 250 l Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 250 l Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 250 l Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 250 l Igasse küvetti lisatakse 750 l tööreaktiivi ning segatakse läbi. Fikseerisin reaktsiooni alguse aeg ja reaktsioonsegusid hoitakse 20 minutit toatemperatuuril. Edasi mõõtsin lahuste optilise tihedust spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm. Tulemused Proov Optiline tihedus ABS Küvett 1: nullproov 0.0000 Küvett 2: viinamarjamahl 0.0890 Küvett 3: viinamarjamahl 0.0732 Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 0.0823 Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 0.0504 Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 0.0203
mõõtkolvid (50 mL), lehter , filterpaber, automaatpipetid (1 ja 5 mL), mõõtsilinder (25 mL), spektrofotomeeter UV-1280, PMMA küvetid 1cm. Kasutatud ained: kriit, raud (III) standardlahus 0,1 mg/mL (FeCl3.6H2O), sidrunhappe lahus 50%, sulfosalitsüülahppe lahus 10%, soolhape 2M, kontsentreeritud ammoniaakhüdraadi lahus, destilleeritud vesi. Kokkuvõte: töö käigus tuli valmistada erinevaid lahuseid ja mõõta nende neeldumispektrid spektrofotomeetriga. Absorbtsiooni põhjal tuli välja arvutada raua kontsentratsioonid lahuses. Töö käigus kasutasime automaatpipette ning pärast seda, kui esimese lahuse valesti tegin, sain aru, et automaatpipette peab samuti silmaga üle kontrollima. Teisel korral sain õige kangusega lahuse.
ja lisame esimesse TKÄ- katseklaasi(see on meie nullproov), ja paneme kaseiini katseklaasi tagasi termostaati. · 5, 10, 15-l minutil võtame veel 3 ml proovi ja lisame seda 2, 3, ja 4-le trikloorädikhappe sisaldavasse katseklaasidele. · Selle tulemusena tekkib katseklaasides valge sade(pikad polüpeptiidid, mis reageerisd TKÄga, sade meile ei ole vaja). · Filtreerime 4 katseklaasi sisaldava lahusi. · Spektrofotomeetriga määrame 4 proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel 280nm. · Kalibrimisgraafikut kasutades leitakse proovide optiliste tiheduste järgi nendes sisalduva türosiini kontsentratsioon. · Saadud andmete alusel koostame graafik, mis väljendub türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust. (Ctyr=f(t)). · Leiame ensüümipreparaadi proteolüütilist aktiivsust(A), kasutade antud valemi: A= Ctyr 103 V1 V2 2/t 181 V3 g
Gaasilise aine spektri mõõtmine 1) Avada gaasiküveti mõlemad kraanid 2) Juhtida tõmbe all uuritav gaas balloonist vastava otsiku abil gaasiküvetti 3) Sulgeda mõlemad kraaanid 4) Asetada gaasiküvett prooviga spektofotometri proovikambrisse 5) Mõõta spekter 6) Interpreteerida Gaasiküveti puhastamne 1) Tõmbe all avada mõlemad kraanid 2) Juhtida gaasiküvetist 5-10 minuti jooksul läbi õhku vaakumpumba abil 3) Kontrollida küveti puhtust spektrofotomeetriga uuesti mõõtes, kui neeldumismaksimune pole enam näha, siis on küvett puhtaks saanuud Isoamüülakohol 33306,87 O-H (m) 2958,34 (vesinkside) C-H (s) 2852,73 C-H (s) 1448,08 CH3 (m) Ained 1.Isoamüül alkohol-isoamyl alcohol-C5H12O M(C5H12O)= 88.1492 g/mol =0.809 g/cm3 CAS: 123-51-3 Keemistemp=130 0 C Sulamistemp= -117 0 C
4. Kogusin eelfraktsiooni mõõtkolbi, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 17,8cm Diameeter: 2,4cm, raadius=1,2cm, seega kolonni maht: Vt=3,14x1,22x17,8=80,53 ml pundumistegur k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x80,53=8,053 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg=80,53-8,053=72,477 ml Fraktsioonide(2ml) üldarv n= Vxmax/2 =72,477/2=36,24 ~36 Kokku võtsin 34 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva eeljooksu maht: 24 ml, seega teeb kokku 34x2= 68+24=92 ml
Kolvis oli 14,5 ml. Lisasin puhverlahust mööda kolonni külge , seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. Kokku oli 35 katseklaasid. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Fraktsioonide analüüsimine Mõõtsin fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Mõõtsin ainult neid fraktsioonid, milles võib silma järgi täheldada vägimatki värvust, sest täiesti värvusete fraktsioonide optilised tihedused on 0. Eluaadi maht kolvis oli Vv=14,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
(2 paralleelproovi) Katseklaasi nr 4 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Katseklaasi nr 5 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/mL ja katseklaasi nr 6 1 mL glükoosilahust, mille kontsentratsioon oli 0,062 mg/mL. Kõigisse kuude katseklaasi pipeteerisin 3 mL tööreaktiivi ja loksutasin, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril. Mõõtsin spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optiliste tiheduste väärtused. Võrdluslahusena kasutasin destilleeritud vett. Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu, siis korrigeerisin kõikide glükoosi sisaldavate lahuste optilise tiheduse väärtuseid. Proov Optiline tihedus Katseklaas nr 1 (Kontrollproov/0-proov) 0,0135 ABS Katseklaas nr 2 (I paralleelproov) 0,1283 - 0,0135 = 0,1148 ABS
Seejärel muudetakse reaktori lüliti asendit, mille järel kandelahus viib kogu süstitud vismuti lahuse läbi reaktori aasa detektori raku poole. Detektorina kasutame UV-Vis spektrofotomeetrit. Vismusti lahuse süstimisel EDTA lahusesse reaktoris toimub reaktsioon Na2-EDTA + Bi(NO3)3 Bi-EDTA + Na+ NO3-, kus Na-ioonid EDTAs asenduvad vismutiga, mille tulemusena tekib värvitu EDTA-Bi kompleksühend, mille absorptsiooni mõõdame spektrofotomeetriga 265 nm juures. Mõõtmisi teostame kolmes korduses. Tulemused Voogsisestusanalüüsi käigus saime erinevate kontsentratsioonide puhul järgmised piikide kõrgused: Proov Kõrgus cm Konts ug/ml Bi konts ug/ml 1 1,7 0,6 0,32 1 1,6 0,6 0,32 1 1,4 0,6 0,32 2 3 1 0,53 2 3,1 1 0,53
Lisasin puhverlahust mööda kolonni külge , seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2 ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. Kokku oli 21 katseklaasid. Kui sinise, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Fraktsioonide analüüsimine Mõõtsin fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Mõõtsin ainult neid fraktsioonid, milles võib silma järgi täheldada värvust, sest täiesti värvusetute fraktsioonide optilised tihedused on 0. Eluaadi maht kolvis oli Vv=12,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2 ml kaupa, siis iga
Seejärel kogutakse eluaati 2 ml fraktsioonide kaupa eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse kuni pärast viimase, kollase aine väljumist on eluaat värvusetuks muutunud. Kokku kogusin eluaati 37-sse katseklaasi. Arvutuste järgi oleks pidanud kasutama (75,58-23)/2 = 27 katseklaasi. 27 katseklaasi kogusin aga kõige intensiivsema kollase värvusega ainet. Ei oska öelda, millest võis selline mahtude vahe tekkida. Edasi mõõdetakse fraktsioonide optilised tihedused spektrofotomeetriga. Tulemused on kantud järgnevasse tabelisse. Katseandmete tabel Fraktsiooni nr Elueerimismah Optiline tihedus, A t = 670 nm = 410 nm = 360 nm V, ml Ühendatud 23 0 fraktsioon 1 25 0,033 2 27 0,330 3 29 0,541 4 31 0,182 0,238
paralleelproovi) Katseklaasi nr 4 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Katseklaasi nr 5 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/mL ja katseklaasi nr 6 1 mL glükoosilahust, mille kontsentratsioon oli 0,062 mg/mL. Kõigisse kuude katseklaasi pipeteerisin 3 mL tööreaktiivi ja loksutasin, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril. Mõõtsin spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optiliste tiheduste väärtused. Võrdluslahusena kasutasin destilleeritud vett. Tulemused Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu (tingitud tööreaktiivi komponentidest), siis tuleb kõikide glükoosi sisaldavate lahuste(katseklaasid 2-6) optiliste tiheduse väärtusi korrigeerida, lahutades neist kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse. Korrigeeritud väärtusi kasutan ka kalibreerimisgraafiku loomisel.
Loksutasin ja panin seista 5 minutit. Järgnevalt viiakse läbi ekstrakti filtrimine ning selleks võtsin 25 ml kuiv mõõtsilinder, kuhu peale paigutasin klaaslehter ning kuiv paberfilter. Eelnevalt saadud segu filtreeritakse seejärel lisatakse tuubi veel 5 ml petrooleetrit, segatakse vortexil ning filtreeritakse. Viimane samm korratakse. Mõõtsin saadud lahuse maht ja sain V = 15,5 ml. Mõõdetakse lahuse neeldumisspekter spektrofotomeetriga lainepikkuste vahemikus 350- 650 nm. Tulemus Neeldumismaksimumid max (nm) Absorptsiooni väärtus (A) 450,0 0,4911 472,5 0,5487 504,0 0,2241 Käsiraamatust: Lükopeen (446; 472; 506) nm E%1cm = 3450 Kapsantiin (504; 475; 462) nm E%1cm = 1905
arvamusel. Nende väitel satub kõige rohkem kloori atmosfääri vulkaanipursetel ja mereveest. Aga teisalt, kuna looduslik kloor lahustub veed, langeb enamus vihmana alla enne kui jõuab osoonikihini. CFC ühendid aga ei lahustu vees ja jõuavad niimoodi stratosfääri, kuhu jäävad pidama aastakümneteks. Eestile lähimad osoonikihi vaatlusjaamad asuvad Riias ja Helsingis. Riias on juba üle 10 aasta tehtud mõõtmisi vana ja küllalt ebatäpse nõukogude päritolu spektrofotomeetriga. Helsingis töötab kaasaegne Breweri spektrofotomeeter. Eestis kontrollitakse ka freoonide hulka atmosfääris. Üks maailma kuuest freoonide monitooringu punktist avati 1987. Aastal Eestis Palmse lähedal Lahemaal. Seal mõõdetakse iga kahe tunni tagant freoonide sisaldust õhus. Andmed saadetakse USA-sse Oregonis asuvasse ülemaailmsesse keskusesse. Meil tehtud vaatlused peavad esindama kogu Põhja-Euroopat. Eesti kohal mõõdetud osoonikihi
mõõtmisel seoses konsentratsiooniga Aatomabsorbtsioon spektomeetria- lahus pihustatakse gaasileeki ja sinna juhitakse spetsiifiline valguskiir. Mida suurem konsentratsioon seda enam valguskiir leegis neeldub. Elementaaranalüsaator- kasutatakse lenduvate el.määramisel org väetisest ja mullast. Proov põletatakse kõrgel tempil ja lenduvad gaasid juhitakse läbi gaasianalüsaatori Kolorimeetriline meetod põhineb lahuse väevi intens mõõtmisel. Mõõtmine spektrofotomeetriga. Mida tumedam toon seda suurem uuritava elemendi konsentratsioon lahuses ja seda suurem on värvuse intens ja seda suurem lahuse opt. Tihendus. Leekfotomeetria- kasutatakse leeki värvivate elementide juures. Pihustatakse aine mõõdetud konsentratsiooniga vesilahusena gaasileegi värvitusse ossa. Kiirgund valguskiired suunatakse fotorakule mis muudab need elektrivooluks mida saab kalvanomeetriga täpselt mõõta. Lubiväetised- väetised mida kasutatakse mulla liigse happesuse
20.Aatomspektroskoopia põhimõte Mõõdetakse vabade aatomite vastasmõju EM kiirgusega. ● neelatud kiirgus (AAS) ● emiteeritud kiirgus (AES) ● fluorestsents kiirgus (AFS) Kasutatakse elementide määramiseks (62 elementi). Mittemetallide määramiseks ei sobi! Ei reageeri aatomi erinevatele oksüdatsiooniastmetele. Eeltöötlus ja metallide lahusesse viimine. Väga tundlik (ppb). 21.Seadme ehitus AAS-s Analoogne spektrofotomeetriga, mis mõõdab EM kiirguse absorptsiooni. Valgusallikaks spetsiaalne lamp ja küveti asemel leek, kus proovi molekulid atomiseeritakse. 22.Õõneskatoodlamp. Valik ja ehitus. Katoodlamp koosneb volframist anoodist ja silindrilise kujuga katoodist. Katoodi materjal peab olema sama, mis määratav aine!! Lamp on täidetud inertgaasiga (Ne/Ar).Anoodi ja inertgaasi kokkupuutepinnal inertgaasi molekulid ioniseeruvad ning liiguvad katoodi poole, kus löövad välja metalli aatomeid
Suurimaks määratavaks kontsentratsiooniks (cmax) on lahuse kontsentratsioon, mille puhul neeldub 90% valgusest. 2 Nendele piirkontsentratsioonidele vastavad järgmised optilised tihedused: D (cmin)= log I0/I= log 100/95= 2,00-1,98= 0,02 D (cmax)= log 100/10= 2,00- 1,00=1,00 Lahusekihi paksuse suurendamisega saame piirkontsentratsiooni vähendada. Eksperimentaalselt mõõdetakse lahuse optilist tihedust spektrofotomeetriga või kolorimeetriga. Spektrofotomeetrid võimaldavad määrata neeldumist kogu spektri ulatuses, teatud lainepikkusel või mingite lainepikkuste vahemikus. Kolorimeetri tööpõhimõte: valgusallikaks on hõõglamp või deuteeriumlamp (1). Valgus langeb prismale või difraktsioonivõrele (või läbib valgusfiltrit) (2), mille tulemusena valgus muudetakse monokromaatseks. Monokromaatne valgus langeb lahusele (3), edasi mõõdetakse uuritava lahuse optiline tihedus (D) ehk absorbtsioon (A)
Suurimaks määratavaks kontsentratsiooniks (cmax) on lahuse kontsentratsioon, mille puhul neeldub 90% valgusest. 2 Nendele piirkontsentratsioonidele vastavad järgmised optilised tihedused: D (cmin)= log I0/I= log 100/95= 2,00-1,98= 0,02 D (cmax)= log 100/10= 2,00- 1,00=1,00 Lahusekihi paksuse suurendamisega saame piirkontsentratsiooni vähendada. Eksperimentaalselt mõõdetakse lahuse optilist tihedust spektrofotomeetriga või kolorimeetriga. Spektrofotomeetrid võimaldavad määrata neeldumist kogu spektri ulatuses, teatud lainepikkusel või mingite lainepikkuste vahemikus. Kolorimeetri tööpõhimõte: valgusallikaks on hõõglamp või deuteeriumlamp (1). Valgus langeb prismale või difraktsioonivõrele (või läbib valgusfiltrit) (2), mille tulemusena valgus muudetakse monokromaatseks. Monokromaatne valgus langeb lahusele (3), edasi mõõdetakse uuritava lahuse optiline tihedus (D) ehk absorbtsioon (A)
· Lasin sademel põhja settida ja selle kohal oleva ekstrakti kandsin teelusika abil filtrile. Ekstrakt sademe kohal oli kollane. · Kordasin eelpool kirjeldatud operatsiooni kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvusetuks. · Määrasin kindlaks ekstrakti kogumahu. Ekstraheerimisel sain ekstraksi 3 ml. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs: · Täitsin klaasküveti poolenisti ekstraktiga. · Järgnes neeldumisspektri võtmine spektrofotomeetriga. · Spektrofotomeetri ekraaline joonistus uuritava lahuse neeldumisspekter, millel märkisin ära need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni ehk optilise tiheduse täpsed väärtused. · Trükkisin neeldumisspektri välja. Spektrofotomeetri andmed: Ekstrakti optiline tihedus, ABS Neeldumismaksimumid, nm 0,309 504,0
Tema andmeil on isegi väga jõukad riigid hakanud oma sellelaadilist tegevust liigse kulukuse pärast kärpima. Eesti peaks praegu oma majandusliku olukorra tõttu tegema osoonikihi uurimisel rohkem koostööd lähemate osoonikihti jälgivate riikidega. Neilt saadav pikaajaline vaatlusmaterjal aitab hinnata osoonikihi olukorda Eesti kohal. Eestile lähimad vaatlusjaamad asuvad Riias ja Helsingis. Riias on juba üle 10 aasta tehtud mõõtmisi vana ja küllalt ebatäpse nõukogude päritolu spektrofotomeetriga. Helsingis töötab kaasaegne Breweri spektrofotomeeter. Eestis kontrollitakse ka freoonide hulka atmosfääris. Üks maailma kuuest freoonide monitooringu punktist avati 1987 aastal Eestis Palmse lähedal Lahemaal, kus mõõdetakse iga kahe tunni tagant freoonide sisaldust õhus. Andmed saadetakse USA-sse oregonis asuvasse ülemaailmsesse keskusesse. Meil tehtud vaatlused peavad esindama kogu Põhja- Euroopat. 6. Osoonikihi paksus Eesti kohal
dekatneerida. · Materjali segatakse jätkuvalt nuiaga ning lastakse sademel põhja settida. · Seejärel kantakse sademe kohal olev ekstrakt teelusika abil filtrile. · Sama korratakse, kuni ekstrakt sademe kohal muutub värvusetuks. · Kõik ekstraktid viiakse samasse kogumisnõusse. · Lõpuks määratakse kindlaks ekstrakti kogumaht ning võetakse neeldumisspekter. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs · Neeldumisspekter määratakse spektrofotomeetriga, mis võimaldab valitud spektriosas lainepikkust muuta. · Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 650 nm ja võrdlusena kasutatakse puhast petrooleetrit. · Töötatakse klaasküvettidega, sest mõdetakse nähtava valguse osas. · Spektrofotomeetri ekraanile moodustub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel näidatakse ära neel lainepikkused, kus paiknevad neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad
First order - Esimene Järk Second order - Teine Järk 7. Mitu korda kasvab järgmise reaktsiooni kiirus, kui suurendada a) CO kontsentratsiooni 2 korda, suureneb 4 korda b) O2 kontsentratsiooni 2 korda? suureneb 2 korda 2CO(g) + O2(g) ↔ 2CO2(g) Reaktsiooni järgud CO ja O2 suhtes võib lugeda võrdseks koefitsientidega reaktsioonivõrrandis. 14. Spektrofotomeetria 1. Sõnastada Lambert-Beeri seadus ja kirjutada valem. 2. Mida mõõdetakse spektrofotomeetriga? Eksperimentaalselt mõõdetakse lahuse optilist tihedust 3. Missugustest osadest koosneb spektrofotomeeter? Valgusallikaks on hõõglamp (volframlamp, nähtavas piirkonnas) või deuteeriumilamp (UVpiirkonnas). Valgus langeb prismale või difraktsioonivõrele, mille tulemusena valgus muudetakse monokromaatseks. Monokromaatne valgus langeb küvetile, milles on lahus, edasi mõõdetakse uuritava lahuse optiline tihedus (D) (absorptsioon (A)). Absorptsioon muudetakse fotoelemendi abil
saamiseks, mis näitab antigeeni kogust proovis. ELISA on heterogeenne meetod, mis immobiliseerib analüüdi lahusest tahkele faasile ehk pinnale. Proovilahus lisatakse eriliste sidumisomadustega statsionaarsele faasile. Üksteise järel lisatakse mitmed reagendilahused, inkubeeritakse ja pestakse. Sellele järgneb lõpplahuse värvimuutus, millest mõõdetakse analüüdi hulka. Kvalitatiivne lugemine põhineb tavaliselt valguse intensiivsuse mõõtmisel spektrofotomeetriga. Tuvastamise intensiivsus sõltub signaali võimendusest analüütilise reaktsiooni vältel. Kuna ensüümireaktsioonid on väga hästi tuntud võimendusprotsessidena, tekitatakse signaal ensüümidega, mis on seotud tuvastusantikehade külge kindlates kogustes, et võimaldada täpne kvantitatiivne määramine. Kasutatakse haiguste diagnostikas, oli esimene laialdasem HIV tuvastusmeetod, rotaviirus väljaheidetes, malaaria. Toiduallergeenide tuvastamine toidutööstuses
välja steriilsele tardsöötmele. Kasvatatakse, loendatakse kolooniad ja tehakse arvutused eeldusel, et ühest elusrakust moodustub üks koloonia. Arvukust määratletakse kui CFU/ml. CFU (kolooniat moodustav ühik, colony forming unit). Meetod ei sobi, kui rakud kleepuvad kokku. Ei sobi ka mütseeliga organismide puhul. 3. mõõta kultuuri optilist tihedust (valguse neeldumist) kasvu vältel välja võetud proovides, näiteks spektrofotomeetriga. Lainepikkus, mida mõõtmiseks kasutatakse, sõltub organismist. Tavaliselt on see 600 nm kandis. 4. määrata biomassi (mg/ml), 5. määrata kultuuri valgusisaldust (mg/ml), 6. määrata DNA sisaldust jne. Enamus mikroobe paljuneb pooldumise teel: Emarakk kasvab ja jaguneb siis kaheks ühesuguseks tütarrakuks. Aega, mis kulub raku pooldumisele e. rakkude arvu kahekordistumisele populatsioonis, nimetatakse generatsiooniajaks.
Tema andmeil on isegi väga jõukad riigid hakanud oma sellelaadilist tegevust liigse kulukuse pärast kärpima. Eesti peaks praegu oma majandusliku olukorra tõttu tegema osoonikihi uurimisel rohkem koostööd lähemate osoonikihti jälgivate riikidega. Neilt saadav pikaajaline vaatlusmaterjal aitab hinnata osoonikihi olukorda Eesti kohal. Eestile lähimad vaatlusjaamad asuvad Riias ja Helsingis. Riias on juba üle 10 aasta tehtud mõõtmisi vana ja küllalt ebatäpse nõukogude päritolu spektrofotomeetriga. Helsingis töötab kaasaegne Brew eri spektrofotomeeter. Eestis kontrollitakse ka freoonide hulka atmosfääris. Üks maailma kuuest freoonide monitooringu punktist avati 1987 aastal Eestis Palmse lähedal Lahemaal. Seal mõõdetakse iga kahe tuni tagant freoonide sisaldust õ ;hus. Andmed saadetakse USA-sse oregonis asuvasse ülemaailmsesse keskusesse. Meil tehtud vaatlused peavad esindama kogu Põhj Euroopat. 20
Bdellovibrio on veebakter ja teda on eriti palju orgaanikarikkas vees, kus on palju baktereid. Müksobakterid- mokroskoopiline viljakeha teke. Klamüüdiad- paksukestalised elementaarkehad ja jagunemisvõimelised retikulaarkehad. Inklusioonikehad. Populatsiooni kasv Vedelkultuuris arvukuse suurenemise jälgimise meetodid: loendada rakke (r/ml). Loenduskambrid. Ei erista elus- ja surnud rakke. väljakülvide meetod. Aitab hinnata elusrakkude arvu. kultuuri hägusust spektrofotomeetriga. Mida rohkem rakke, seda hägusem on lahus. biomassi määramine (mg/ml) (seente ja aktinobakterite puhul palju parem kui lihtsalt kolooniate loendamine) kultuuri valgusisaldus (mg/ml) DNA sisaldus Generatsiooniaeg- aeg, mis kulub raku pooldumisele ehk rakkude arvu kahekordistumisele. Erinevatel bakteritel erinevad, lühikesed generatsiooniajad (15-20 min) iseloomulik E. coli'le. Soodsates tingimustes kasvad mikroobirakkude arv eksponentsiaalset. Generatsiooniaeg
• kas isotoobiga – radioimmunoloogiline meetod (RIA) või • ensüümiga – ensüümimmunoloogiline meetod (EIA). Fikseeritakse Ag-AK kompleks spetsiifilise antikehaga ja seejärel lisatakse eelmisele antikehale spetsiifiline antikeha, mis on vastavalt märgistatud. Kompleksis fikseerunud radioaktiivsus määratakse loendajates, ensümaatiline aktiivsus ensüüm-substraadile omases värvusreaktsioonis (spektrofotomeetriga). Lateksaglutinatsioon. On vähem tundlikum kui RIA ja EIA. Väikestele latekspartiklitele on kantud viirusspetsiifilised antikehad, antigeeni lisamisel tekivad nähtavad aglutinaadid. Saab määrata rota- ja adenoviirusi roojas. VIIRUSVASTASTE ANTIKEHADE MÄÄRAMINE PATSIENDI VERESEERUMIS. Western immunoblotting on väärtuslik analüütiline meetod antikehade määramiseks eri viirusvalkude suhtes. Selleks toimub esiteks tuntud viiruse puhastamine, edasi eraldatakse valgud
annaabi.ee 
