12. Milline on nn. kolmanda põlvkonna sekvenerimismeetodite põhiline erinevus esimese ja teise põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa c) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa
See on tänapäeva bioteaduses üks olulisemaid tehnikaid. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab lühikese ajaga paljundada spetsiifilist DNA-d in vitro (katseklaasis) lähtudes üliväikesest DNA kogusest. Selles kasutatakse praimerite alusel sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DNA erinevatele piirondadele ning mille vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DNA lõike. See koosneb kolmest etapist: a) sekveneeritav DNA denatureeritakse kuumutamisel b) DNA hübridiseeritakse praimeri üleküllusel c) DNA polümeraas muudab praimeritevahelised üksikahelalised lõigud kaksikahelalisteks. Praimeri 3´-OH ots on sünteesi algussaidiks. DNA fragmentide arv kasvab eksponentsiaalselt. Tsüklites tekib vastaalt 2, 4, 8, 16 jne ahelat. 46. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnooogiat? PCR mängib tänapäeval geenitehnoloogias olulist rolli. Seda kasutatakse laialdaselt
5.2) Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, miks ekstensioon termineerub? 3' otsas on vesinik, ei saa moodustuda fosfodiesterside järgmise nukleotiidiga. 5.3) Pikemad järjestused (>1000 nt) sekveneeritakse järestuse otstest kahe erineva vastassuunalise praimeriga kahes erinevas katseklaasis. Miks ei teostata sekveneerimist kahe erineva praimeriga ühes katseklaasis? Sest järjestused kuhjuksid üksteise peale ning pildi pealt pole neid kerge eristada. 5.4) Sekveneeritav DNA sade lahustatakse formamiidis, mis sisaldab 5 mM lõppkontsentratsiooniga EDTA-d (FA+EDTA lahus). Kui palju on vaja pipeteerida 800 l FA+EDTA tegemiseks 0,5 M EDTA lahust? 8 l. Kokkuvõte: Mastermix oli millegi pärast inaktiveerunud ning DNA-d ei õnnestunud sekveneerida. 16
jääkide likvideerimine bakterite abil). Kloonitud geenid on kasulikud tegemaks uuritavast geenist kergesti hallatavaid koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku. Sangeri sekveneerimise põhimõte. Kasutatakse didesoksüribonukleotiide, mis erinevad desoksüribonukleotiididest selle poolest, et suhkrujäägis ei ole 3’ otsas hüdroksüülrühma, mille tõttu ei saa ahel edasi minna, vaid süntees jääb selle koha peal pidama. Sekveneeritav DNA pannakse reaktsioonianumasse tavaliste desoksüribonukleotiididega ja sünteesitud didesoksüribonukleotiididega. Reaktsioonid viiakse läbi iga lämmastikalust sisaldava nukleotiidiga eraldi: igas eri anumas on sama tähega lõppevad lõigud. Järjestuse paika panemiseks viiakse läbi geel-elektroforees. Kõik tekkinud DNA lõigud on erineva pikkusega ja see mõjutab nende liikumist geelis: lühemad lõigud liiguvad kaugemale, pikemad lähemale
rühma 3´asendis ja ta ei ole võimeline moodustada fosfodiestersideme järgmise nukleotiidiga. 5.3) Pikemad järjestused (>1000 nt) sekveneeritakse järestuse otstest kahe erineva vastassuunalise praimeriga kahes erinevas katseklaasis. Miks ei teostata sekveneerimist kahe erineva praimeriga ühes katseklaasis? Kahe erineva praimeriga ei teostata sekveneerimist ühes katseklaasis, kuna sel juhul moodustub segasegment ja me ei saa sekveneerimise tulemuse näha. 5.4) Sekveneeritav DNA sade lahustatakse formamiidis, mis sisaldab 5 mM lõppkontsentratsiooniga EDTA-d (FA+EDTA lahus). Kui palju on vaja pipeteerida 800 l FA+EDTA tegemiseks 0,5 M EDTA lahust? On vaja pipeteerida 8µl 0,5M EDTA lahust. 13 Töö nr 6: Rekombinantse DNA järestuse bioinformaatiline analüüs (teostatakse auditooriumis/arvutiruumis või iseseisvalt) (1) Saadud DNA järjestuse editeerimine, vastavalt saadud elektroforegrammile, kasutades programme
Esimeses tsüklis sünteesitakse lähtuvalt praimeritest nn pikad DNA- lõigud, mis ületavad teise vastaspraimeri seondumissaite. Teises tsüklis seondub teine vastaspraimer juba sünteesitud DNA-ahelale ning selle ahela teine ots on esimese praimeri seondumissait. Järelikult toimub edasin süntees praimerite seondumissaitide vahel ning selle tulemusel moodustuvadki sama pikkusega DNA- fragmendid. 1. Sekveneeritav DNA denatureeritakse kuumutamisel 92- 95 kraadi juures 30 sekundit 2. Denatureeritud DNA hübridiseeritakse praimeri üleküllusel, 50-60 kraadi juures 30 sekundit, sõltuvalt praimeri nukleotiidsest järjestusest 3. DNA polümeraas muudab praimeritevahelised
annaabi.ee 
