4.Sobib suuremate fragmentide sisseviimiseks 12. Kuidas on võimalik ligeerida sisend vektorisse õige suunaga? Kõige lihtsam on lideerida kleepuvate otstega DNA fragmentdid. DNA fragmendi paigutamiseks vektorisse õige suunaga, kasutatakse 2 piiravat restriktsiooni ensüümi DNA läbitöötamiseks, et moodustaksid erinevad otsad. Need erinevad otsad takistavad ligeerimise tagasipöördumist ja aitavad sisestada fragmendi õigel suunal. Samas peab vektori ja sisendi läbitöötlema sama restriktaasidega, vastavalt suunale, kuidas tahetakse kloonida. Kui ei ole võimalik kasutada kahte piirkonda, siis kasutatakse defosforüleerimist. 13. Kuidas on võimalik ligeerida vektorisse DNA fragment, kui vektoril puuduvad restriktsiooni kohad (,,site")? Võib sünteetiliselt luua need restriktsioonikohad. Või esineb ka meetod, mille kirjeldas Tsenq H 1999aastal. Meetod põhineb ,,sticky" otste moodustumisel kasutades praimeri disaini ja lambda eksonukleaasi PCR reaktsioonis.
2) Pöördtranskriptaasiga sünteesiti komplementaarsed cDNA-d üks neist geen GH1 3) DNA polümeraasiga sünteesiti cDNA-dele vastasahelad saadi mitu kaksikahelalist DNA-d üks neist sisaldas geeni GH1 Restriktaasid Et teada saada, milline DNA sisaldab GH1 geeni järjestust, geenid kloneeriti sisestati plasmiidi Paljunesid koos plasmiidiga Selleks: * eraldati bakteri plasmiidid * lõigati restriktaasidega Restriktaasid tunnevad ära teatud kindla järjestuse palindroomi: "Madam I´m Adam" Mõlemalt poolt lugedes sama info palindroom Ühe ahela 5`- 3` suunas GAATTC, vastasahela 5`- 3` suunas GAATTC Kõige tuntum restriktaas - EcoR1 Ei lõika DNA kahte ahelat korraga otse aluspaaride vahelt, vaid nii, et jäävad üksikahelalised osad kleepuvad otsad Need seonduvad teiste fragmentide kleepuvate otstega Restriktaasid
Tsentrifuugin Jätan üleöö ligeerima +4 kraadi juurde. Millise konstrukti oma töö käigus kloneerisin? Ligeerisin sellise konstrukti, kus bSTBlue-1 vektoris EcoRV saidis on minu insert ehk DST geen. Milleks kasutasime kloneerimisel pSTBlue-1 vektorit? Mis teeb selle eriliseks? See on meie vahevektor ja see on väga hea kuna võimaldab sini-valge skriinimist ja seal on mõlemal pool EcoRV saiti EcoRI sait, ehk seda oli väga lihtne restriktaasidega lõigata. Kas sini-valge selektsiooni kasutamisel võib õige koloonia olla ka sinine? Miks? Vahel ikka juhtub. Insert võib olla väga väike, seega lacZ jääb terveks ja koloonia värvub ikkagi siniseks. Kui tahame 5kb suurusesse vektorisse ligeerida 1000bp pikkust inserti, siis kui palju vektorit peame 50ng inserdi kohta võtma? Soovitud vektori:inserdi suhe on 1:5. Vektor : 5000bp Insert: 1000bp
6. Isiku molekulaarbioloogiline tuvastamine, DNA sõrmejälgede metoodika. Polümorfsed markerid; Tandem(kordus)järjestus (STR) ja SNP (ühenukleotiidne erisus/varieeruvus). Konspekt + Õp lk 50 - 56. Tuvastamine: vt vihikust STR, SNP jms. DNA sõrmejälgede metoodika- põhineb nähtusel, et iga inimese sõrmejärljed on kordumatud. Genoomis palju muutlikke piirkondi, mida saab eristada fragmentide pikkuse järgi. Genoomi restriktaasidega töödeldes saadakse eri pikkusega DNA-fragmendid, mille pikkusemuster on eri indiviididel erinev. POLÜMORFSED MARKERID- kahe või enama alleelina esinev tunnus STR- lühike kordusjärjestus; suur varieeruvus, et iga indiviid on teistest eristatav. Analüüsi käigus kordistatakse proovis kindlaid DNA järjestusi. SNP- üksiku nukleotiidi polümorfismid. Haigusi ei põhjusta enamasti, kuid aitavad kindlaks määrata haigestumise tõenäosust. 7
Sellised proovid võimaldavad mis tahes elujärgul avalduvaid geneetilisi puudeid tuvastada juba enne sündi, idegi varastes embrüotes enne nende siirdamist. Üha laiemalt rakendatavaks on saanud nn. DNA-sõrmejälgede metoodika. See nimetus on tuletatud 19. sajandi lõpul avastatud nähtusest, et iga inimese sõrmejäljed on kordumatud. Inimese DNA-järjestuste uurimisel selgus, et genoomis on rohkesti muutlikke piirkondi e. lookusi, mida saab eristada fragmentide pikkuse järgi. Genoomi restriktaasidega töödeldes saadakse eri pikkusega DNA-fragmendid, mille pikkusmuster on eri indiviididel märgatavate erinevustega. Eri pikkusega DNA-fragmendid eraldatakse elektroforeesiga. Tulemuseks saadakse pilt, mis sarnaneb ribakoodiga. Suurima läbimurde DNA-sõrmejälgede metoodika arengusse tõi 1983.a. leiutatud polümeraasse ahelreaktsiooni meetodi kasutuselevõtt. See meetod võimaldab mõne raku olemasolu korral paljundada kindlat DNA-lõiku mõne tunni jooksul miljonis koopias, mis
kust lastakse läbi mitteliikuva või väheliikuva faasi vedelat või gaasilist vedelikku või segu ja siis tänu sellele jagunevad lõpuks ained erinevalt...tekivad erineva kiirusega komponentide grupid...mis siis hiljem tehakse kindlaks vastavate füüsikaliste meetodite või keemiliste reaktsioonide kaudu 51. Elektroforees. Genoomis on rohkesti muutlikke piirkondi e lookusi, mida saab eristada fragmentide pikkuste järgi. Genoomi restriktaasidega töödeldes saadakse eri pikkusega DNA fragmendid, mille pikkusmuster on eri indiviididel erinev. Need eri pikkusega fragmendid eraldatakse elektroforeesiga ja tulemuseks on pilt, mis sarnaneb ribakoodiga. Selle meetodi abil saab indiviide eristatada ja isadust kindlaks teha. 52. Nukleiinhapete hübridiseerimine. Põhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerimisel, mis tähendab, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on võimelised taastama oma endise struktuuri
klass II restriktaase, mis tunnevad kindlaid 4 8 aluspaari pikkusi DNA järjestusi ning lõikavad DNA d ainult nendest spetsiifilistest kohtadest. Nii kaitsevad restriktaasid baktereid näit faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega. Paljude restriktaasidega lõikamise tulemusel tekivad DNA fragmendid, mille otstes on lühikesed, 2 4 nukleotiidi pikkused üheahelalised alad. Neid nimetatakse kohesiivseteks e kleepuvateks otsteks, kuna nad võivad paarduda teiste sama restriktaasiga lõigatud DNA üleulatuvate otstega. Mõned restriktaasid tekitavad 5' (EcoRI), teised 3' (PstI) üleulatuva otsaga fragmente. On ka restriktaase, mis tekitavad tömpotsalisi fragmente (SmaI). 44. DNA kloneerimise etapid. bläblä 45
transformeeritud, saab kasvatada nii ampitsilliini, kanamütsiini kui ka mõlemat sisaldavad keskkonnas seeläbi saab vähendada ohtu, et plasmiidi mitte sisaldavad rakud tekitavad saaste. Vektor sisaldab lacZ operoni, mis võimaldab kasutada inserti sisaldavate rakukolooniate tuvastamiseks sini-valge meetodit. Lisaks sellele on vektoris palju erinevaid restriktsioonisaite, see võimaldab vektorisse sisestada erinevate restriktaasidega töödeldud otstega inserte. d) Plasmiid sisaldab lacZ operoni, mis kodeerib -galaktosidaasi. Kui kasvusöötmele lisada X-gali (laktoosi analoog, kus galaktoosiga on glükoosi asemel seotud inool), siis rakkudes, kus lacZ lugemisraam on terve, hüdrolüüsib -galaktosidaas X-galis glükosiidsideme, vabanevad galaktoos ja 5-bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, millest viimane dimeriseerub ja oksüdeerub tekib indigosinist värvi dikloro-dibromo-indigo,
kloneerimisvektorisse sisestatud järjestus edasi mõnda ekspressiooni vektorisse. Selline vektor sisaldab vajalikke järjestusi valgu ekspressiooniks rakkudes, aga ka bakteris paljundamist võimaldavaid elemente, kuid millesse kloneerimine otse PCR-ist oleks liiga tülikas. Seega restrikteeritakse esialgsest bakteriaalsest vektorist soovitud järjestus uuesti välja ja ligeeritakse samade restriktaasidega lõigatud ekspressioonivektori MCS-i. Uut konstrukti paljundatakse jällegi algul bakterites ja puhastatakse välja suurem kogus DNA-d. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81.
kvaliteet, välistemperatuur, päikesekiirgus, patogeensed faktorid, pidamistingimused. Keskkonna ja genotüübi mõju osatähtsuse väljaselgitamine teatud tunnustele kasutatakse kaksikute uurimisi (ühemunakaksikutel identne genotüüp). 2. kontrolltöö 3. 1. Mis on rekombinant-DNA? Restriktaaside abil loodud DNA molekul, mis looduses ei esine. 2. Millised on rekombinant-DNA tehnoloogia põhimeetodid? DNA lõikamine restriktaasidega DNA kloonimine DNA sekveneerimine – nukleotiidse järjestuse määramine Insenerigeneetika – DNA järjestuse muutmine ja GMO-de loomine – muudetud geneetilise materjali viimine organismidesse. 3. Mis on restriktaasid? Endonukleaasid, mis lõikavad DNA-d kindlatest kohtadest (äratundmisjärjestustest – ÄJ). ÄJ on 4-8 bp pikkune DNA järjestus. Kui restriktaasid lõikavad, siis võib tekkida kas EcoRI-ga
rakutsükli regulatsioonis. Mis on MARid ja nende tähtsus? Matrix-attachment regions, alad kromatiinikiududel, mis seonduvad võrgustikule (maatriksile), organiseerivad kromatiini struktuurseteks domeenideks (lingudeks), neil on oluline roll geeniekspressiooni reguleerimisel, hoiavad ära DNA vaba liikumise tuumas. 15. Kirjelda kromatiini immunosadestamismeetodit. Kromatiinseoseliste valkude ja DNA vahele luuakse ristsidemed, rakud lüüsitakse, neis olev DNA tükeldatakse restriktaasidega, lüsaadile lisatakse huvitava valgu spetsiifiline antikeha, moodustub stabiilne antikeha-valk- DNA kompleks, mida on lihtne eraldada, seejärel eemaldatakse valk-DNA kompleks ja nende vahel olevad ristsidemed lõhutakse, proteinaasiga töötlemise järel on lahuses valgud ja DNA eraldi, DNA puhastatakse välja, selleks ajaks on proovi jäänud vaid see osa DNAst, millega oli seotud huvitav valk, tuvastatakse uuritava valgu seondumispiirkond. 16. Eukarüootsete kromosoomide morfoloogia
Transgeenne analüüs. Reporter geen on geen, mida lisatakse teise huvipakkuva geeni uurimiseks geeni sisse (rakukultuuris, loomadesse või taimedesse). Neid lisatakse sellepärast, et tunnused, mida nad end ekspresseerivates loomades tekitavad, on kergelt äratuntavad ja mõõdetavad. Üldjuhul kasutatakse, et uurida, kas huvipakkuv geen ekspresseerub. LacZ on geen, mida ekspresseerides hakkab organism tootma laktoosi. Rekombinantse DNA meetod DNA jupid saadakse restriktaasidega, mis lõikavad tömbid otsad. · Kasutatakse saamaks teada teatud geenide funktsiooni. Võetakse uuritav geen ja hakatakse mõnes rakus (nt bakter) sellelt geenilt valku tootma ning vaadatakse, kuidas rakk reageerib · DNA kättesaamiseks lõhutakse rakk katki, lisatakse etanooli ja selle tulemusel sadenevad nukleiinhapped põhja; kromosoomi ja plasmiidi eraldamiseks töödeldakse sooladega, mille tagajärjel
kromosoomiväliseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad huvipakkuvat DNA-d paljundada ja selles sisalduva geneetilise informatsiooni avaldumist uurida bakterirakus. Lisaks on konstrueeritud hulgaliselt ka eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset
kromosoomiväliseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad huvipakkuvat DNA-d paljundada ja selles sisalduva geneetilise informatsiooni avaldumist uurida bakterirakus. Lisaks on konstrueeritud hulgaliselt ka eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset
annaabi.ee 
